丁酸钠在糖尿病导致动脉内皮氧化损伤中的保护作用及机制研究

【背景】糖尿病是一种严重威胁人类健康的慢性疾病,发病率逐年上升,已成为愈来愈严重的公共卫生问题。糖尿病大血管并发症是其主要致死、致残原因。糖尿病所致动脉内皮功能障碍是引起大血管并发症的主要原因,糖尿病血管病变的基本病理改变为动脉粥样硬化斑块形成,其主要原因是长期暴露于高血糖下导致血管内皮损伤,进而导致动脉粥样硬化的发生。氧化应激在糖尿病引起的动脉内皮功能障碍的发生中起关键作用。已有研究表明,氧化应激可降低内皮介质一氧化氮的有效生物利用度,进而导致血管内皮舒张功能障碍。糖尿病引起的动脉内皮氧化应激可与炎症反应相互促进、放大,形成正反馈循环,促使白细胞、单核细胞浸润血管壁,诱导动脉粥样硬化的发生发展。因此,抑制氧化应激是减轻糖尿病动脉内皮功能障碍、阻断糖尿病动脉并发症进展的有效策略。NRF2是细胞自身抗氧化能力的主调控因子,作为转录因子可启动多种抗氧化基因的转录,产生抗氧化剂,对糖尿病诱导产生的自由基起清除作用。NRF2是糖尿病心血管并发症的重要保护性因子。我们前期研究发现,与野生型(WT)糖尿病小鼠相比,Nrf2基因敲除(KO)糖尿病小鼠的心脏、肾脏损伤更重;激活NRF2可减轻WT小鼠糖尿病心肌病和糖尿病肾病。因此,激活NRF2可能是减轻糖尿病动脉内皮损伤的有效策略。目前对激活NRF2相关机制研究大多集中在特异性抑制KEAP1。NRF2表达和功能受kelch样ECH相关蛋白1(KEAP1)负调控。而其他对NRF2调控机制研究较少,上调Nrf2基因转录可能是激活NRF2的另一有效策略。然而目前Nrf2基因转录水平的调控机制尚不明确,也缺乏有效手段。组蛋白乙酰化/去乙酰化修饰是细胞内基因表达的重要调控机制。通常,组蛋白乙酰化酶(HAT,如P300/CBP)使组蛋白乙酰化,导致染色质空间结构开放,利于转录因子和辅激活因子等结合在基因启动子区,激活基因转录;与之相反,组蛋白去乙酰化酶(HDAC)使组蛋白去乙酰化,导致染色质空间结构缩紧,妨碍转录因子和辅激活因子等结合在基因启动子区,抑制基因转录。丁酸钠(NaB)是一种短链脂肪酸,是肠道内益生菌(酪酸梭菌等)发酵的非消化糖(低聚寡糖、膳食纤维等)的代谢产物。NaB是HDAC的强抑制剂。我们前期发现,NaB可抑制小鼠糖尿病肾脏HDAC活性,并通过激活NRF2表达和功能减轻糖尿病肾病。进一步研究发现,NaB可显著提高糖尿病小鼠肾脏Nrf2 mRNA水平。因此推测,NaB可能通过抑制HDAC,在转录水平激活Nrf2基因表达及功能。NaB对糖尿病动脉内皮损伤的作用尚无报道,且机制未明。本研究以C57BL/6 WT(Nrf2+/+)、Nrf2 KO(Nrf2-/-)小鼠,及动脉内皮细胞为研究对象,观察NaB对糖尿病动脉内皮损伤的作用,探讨NaB调控Nrf2基因表达的作用机制,旨在探索糖尿病动脉内皮损伤形成的新机制,并为糖尿病大血管并发症的防治提供关键、有效的干预靶点。【目的】探讨NaB对糖尿病导致动脉内皮氧化损伤的作用及机制。【方法】1.采用小剂量多次腹腔注射链脲霉素(STZ)方法建立小鼠糖尿病模型。2.0、28、56、84、112和140天检测血糖水平。HE染色测定主动脉中膜增生面积;离体微血管张力测定系统测定小鼠主动脉收缩反应与舒张反应。3.qPCR检测主动脉组织及细胞内炎症相关因子mRNA表达、Nrf2及其下游抗氧化基因mRNA表达。4.免疫组织化学染色(IHC)检测主动脉组织内氧化应激、炎症炎症反应相关蛋白表达水平,NRF2及其下游抗氧化蛋白的表达。5.Western Blot检测不同组别细胞内NRF2等相关蛋白表达。6.应用ROS及MDA检测试剂盒检测细胞内ROS和MDA水平。7.应用核分离试剂盒分离细胞核,Western Blot分别检测细胞内t-NRF2、c-NRF2、n-NRF2。8.应用HDAC试剂盒检测NaB对HDAC活性影响。9.应用染色质免疫共沉淀(ChIP)试剂盒检测NaB对Nrf2基因启动子区AHR、P300、H3K9ac结合影响。【结果】1.NaB对小鼠血糖水平无明显影响。2.在体内实验中,NaB减轻了野生型糖尿病小鼠的主动脉中膜增生、收缩及舒张功能障碍,而在Nrf2 KO糖尿病小鼠中NaB则无上述作用。3.NaB可降低野生型糖尿病小鼠主动脉组织iNos、Vcam-1 mRNA的表达,并抑制了高血糖/高糖引起的氧化应激(3-NT、4-HNE、ROS、MDA)和炎症反应(Vcam-1、Icam-1)。然而,在Nrf2 KO糖尿病小鼠和高糖+Nrf2-siRNA处理的动脉内皮细胞中,NaB的上述作用均消失。4.在体内实验及细胞实验中,NaB能够增加Nrf2及其下游相关抗氧化基因Nqo1、Ho-1的表达。然而,NaB的上述作用在Nrf2 KO糖尿病小鼠和高糖+Nrf2-siRNA处理的动脉内皮细胞中消失。5.在高糖处理的内皮细胞中,NaB提高了细胞整体NRF2、细胞核NRF2、细胞质NRF2水平。然而与SFN不同,NaB未能增加NRF2进入细胞核的比例,而是显著提高了Nrf2 mRNA水平。6.NaB可显著增加Nrf2基因启动子区AHR、P300、H3K9ac的结合,逆转高糖对上述现象的抑制作用。7.在高糖处理的内皮细胞中,P300特异性抑制剂C646逆转了NaB对Nrf2基因表达的调控作用。【结论】1.NaB通过激活NRF2信号通路减轻糖尿病导致的动脉内皮氧化应激、炎症反应和功能障碍。2.NaB在转录水平激活Nrf2基因表达和功能,不增加NRF2核易位。3.NaB抑制HDAC活性,增加转录因子和辅激活因子在Nrf2基因启动子区的结合。4.P300是介导NaB调控Nrf2基因转录的关键性因子。