蛋白酪氨酸激酶Src家族对耳蜗螺旋神经节神经元电压门控性钠通道的调节

耳聋在耳鼻咽喉头颈外科常见病。由于滥用抗生素、噪声的污染、人口老龄化及高危遗传的婚姻等诸多因素,我国难治性感音神经性耳聋发病率正逐年增加。耳聋已成为我国第一致残疾病。因此防治耳聋,已成为临床上迫切需要解决的顽症之一。 Src家族是一种非受体型蛋白酪氨酸激酶,它通过催化底物酪氨酸残端的磷酸化反应,将ATP的磷酸基团转移到底物,从而改变底物的构象及活性。Src家族共有9个成员,广泛分布于全身各组织和细胞中。Src家族成员都有相似的结构,如共有6个功能结构域,其中C-末端的酪氨酸Tyr527和激酶区活化环的Tyr416在调节Src家族酶活性过程中起着关键的作用。已知在中枢神经系统,Src家族参与调节神经系统发育、迁徙、突触可塑性等生理过程,并介导缺血性损伤等兴奋毒性作用,如Src家族可通过磷酸化与细胞迁徙相关的蛋白,调控神经元在发育过程中的迁徙过程；Src家族成员Src可通过调控兴奋性受体NMDA受体磷酸化水平,促进长时程增强或长时程抑制的产生,调节突触可塑性,这被认为与癫痫、阿茨海默氏病等神经系统疾病的发病机制有关。有研究发现抑制蛋白酪氨酸激酶Src家族可有效缓解噪声引起的的耳蜗损害。因此,Src家族可能参与耳聋的病理生理过程。 听觉信息在耳蜗转换为听神经动作电位,传向中枢。听神经动作电位发放异常,可导致听力下降。动作电位的产生主要取决于电压门控性钠通道和钾通道的开放。目前已明确调控听神经元电压门控性离子通道磷酸化水平,可影响听神经动作电位发放。研究虽已证实Src家族可参与调控电压门控性钠通道和钾通道,但对于Src家族在神经系统直接调控钠通道和钾通道的机制,目前并不明确；尤其是在听觉神经系统的研究,尚处于空白。耳蜗螺旋神经节神经元(SGN)是初级听觉神经元,是连接外周毛细胞和听觉中枢的重要枢纽,听神经动作电位起于SGN。已知SGN常是噪声和耳毒性药物等兴奋毒性作用的靶点。SGN的电压门控性钠通道和钾通道开放异常可影响听力。因此在本实验中,通过细胞原代培养技术,建立SGN体外培养模型；利用全细胞记录膜片钳技术,观察内源性Src家族被抑制后对SGN电压门控性钠通道和钾通道的作用特点,明确Src家族是否参与调控听神经系统动作电位的传导。通过观察Src家族各种调节因子对SGN电压门控性钠通道和钾通道的I-V曲线,钠电流宏观激活和失活(macroscopic activation and inactivation),电导,激活曲线,稳态失活曲线和失活后恢复曲线等电生理学特性的作用,明确Src家族在调控听神经动作电位过程的作用机制。最后观察Src家族代表性成员Src对SGN钠通道和钾通道的作用。通过本实验,将有利于揭示Src家族在听神经动作电位传播过程所扮演的角色,也为临床上耳聋防治提供新的理论指导。 实验内容包括以下三部分： 第一部分：Src家族对螺旋神经节神经元电压门控性钠通道和钾通道的调控研究目的：观察蛋白酪氨酸激酶Src家族对原代培养的大鼠螺旋神经节神经元(SGN)电压门控性钠通道和钾通道电生理学性质的作用,探讨Src家族对SGN听神经动作电位产生过程的影响。 研究方法：将SGN从耳蜗中分离出并原代培养,.24h后结合免疫荧光染色技术,首先利用抗N-200抗体和Hoechst3342鉴定SGN,然后用抗Src家族抗体,明确Src家族在SGN的表达。采用全细胞记录膜片钳技术,证实去极化刺激引出的内向和外向电流分别为电压门控性钠通道电流和电压门控性钾通道电流。Src家族被抑制后,观察同时记录的SGN电压门控性钠通道和钾通道电流的变化,明确Src家族对钠通道和钾通道的作用特点。再用无钠(NMDG)细胞外液置换正常NaCl细胞外液,观察Src家族被抑制后,对SGN电压门控性钾电流和1-V曲线的影响,明确Src家族对SGN钾通道作用。 结果： (1)抗N-200抗体特异标记SGN胞膜,Hoechst3342可特异标记SGN胞核,证实从耳蜗分离出来的细胞为SGN。利用抗Src家族抗体,证实Src家族在SGN表达。 (2)TTX和CsCl可分别阻断由去极化刺激引出的内向电流和外向电流,证实内向电流为电压门控性钠通道电流(工Na),外向电流为电压门控性钾通道电流(IK)。 (3)10μM PP2作用后,抑制SGN的INa,INa为作用前59.6±15.7%(n=9, P <0.05);2μM SU6656作用后也抑制INa,INa为作用前68.6±7.5%(n=5,P<0.05)。而对照物10μM PP3和对照溶液作用后不影响SGN的INa。 (4) PP, PP3, SU6656以及对照溶液均不影响同时记录的IK。 (5)在NMDG细胞外液条件下,PP2, SU6656及对照溶液不影响钾通道I-V曲线的反转电位,也不影响IK。 结论：Src家族抑制后可抑制SGN电压门控性钠通道电流,但对电压门控性钾通道作用不明显。 第二部分：Src家族对螺旋神经节神经元电压门控性钠通道的调控及其电生理学机制 研究目的：观察Src家族在抑制和激活条件下,对SGN电压门控性钠通道电生理学特性的影响,明确Src家族调控钠通道机制。 研究方法：通过近距离给药方式,观察Src家族抑制剂PP2和SU6656,以及PP2拟合物PP3对SGN电压门控性钠通道电流(INa),I-V曲线,钠电流宏观激活和失活,电导,激活曲线,稳态失活曲线和失活后恢复曲线的作用。Src家族激活剂EPQ(pY)EEIPIA及其对照物则通过细胞内给药途径,同样观察Src家族激活后,SGN钠通道电流,I-V曲线及动力学性质的变化。 结果： (1)10μMPP2作用后抑制SGN的INa,INa为给药前59.7±10%(n=7, P＜0.05)。2μM SU6656作用后也抑制INa,INa为给药前62±8.8%(n=7,P<0.05)。而1011M PP3和对照溶液不影响INa。 (2)PP2和SU6656不影响SGN INa的宏观激活和失活。 (3)PP2和SU6656作用后均抑制钠通道的I-V曲线峰值,但不影响1-V曲线钠通道反转电位。而PP3不影响I-V曲线。 (4)PP2作用前后,SGN钠通道的电导值分别为(6.7±1)nS和(5.2±0.7)nS(n=7,P<0.05)；而SU6656作用前后,SGN钠通道的电导值(11±2.4)nS和(7.9±1.9)nS(n=7,P<0.05)。PP2和SU6656均抑制SGN钠通道的电导。PP3不影响对SGN INa的电导。 (5)PP2和PP3, SU6656均不影响钠通道激活曲线。 (6)PP2作用前后,钠通道的半失活电压(V1/2)分别为(-69.4±0.8)mV和(-77.2±0.5)mV,斜率κ分别为(9.5±0.4)和(9.6±0.4)(n=11,P<0.05),PP2使钠通道的稳态失活曲线移向超极化方向。SU6656作用前后,V1/2分别为(-64.6±0.3)mV和(-70.1±0.4)mV,κ分别为(7.1±0.3)和(7.7±0.4)(n=9,P<0.05),SU6656也使钠通道的稳态失活曲线移向超极化方向。PP3不影响INa的稳态失活曲线。 (7)PP2作用前后,钠通道失活后恢复过程的时间常数分别为(7.8±4.5)ms和(17.4±5.9)ms(n=6,P<0.05),SU6656作用前后,钠通道失活后恢复过程的时间常数分别为(5±2.8)ms和(11.2±2.2)ms(n=6,P<0.05)。PP2和SU6656均延缓失活恢复过程。PP3不影响钠通道失活后恢复过程。 (8) EPQ(pY)EEIPIA(1mM)作用后增强INa，INa为作用前131.3±5.2%(n=12,P<0.05)。对照物EPQYEEIPIA(1mM)和空白对照不影响INa。 (9) EPQ(pY)EEIPIA不影响SGN INa的宏观激活和失活。 (10) EPQ(pY)EEIPIA作用后增强钠通道的I-V曲线峰值。EPQ(pY)EEIPIA和EPQYEEIPIA均不影响钠通道的I-V曲线反转电位。 (11)EPQ(pY)EEIPIA作用后增强SGN钠通道的电导,作用前后钠通道的电导值分别为(8.2±1.3)nS和(9.7±1.4)nS(n=9, P＜0.05)。EPQYEEIPIA不影响SGN钠通道的电导。 (12) EPQ(pY)EEIPIA作用前后,钠通道半激活电压(V1/2)分别为(-36.4±0.3)mV和(-40.2±0.4)mV,斜率K为(3.5±0.3)和(3.4±0.4)(n=9,P<0.05),钠通道的激活曲线移向超极化方向。EPQYEEIPIA不影响钠通道的激活曲线。 (13) EPQ(pY)EEIPIA和EPQYEEIPIA均不影响钠通道的稳态失活曲线。 (14) EPQ(pY)EEIPIA作用前后,SGN钠通道的失活后恢复时间常数分别为(5.6±2.5)ms和(6.1±2.8)ms(n=10, P＞0.05)。EPQ(pY)EEIPIA不影响钠通道的失活后恢复过程。 结论：Src家族的激活可上调SGN电压门控性钠通道的功能。Src家族不仅影响钠通道的电导,而且同时作用于钠通道的激活区和失活区,影响其激活过程和失活过程。Src家族对钠通道激活过程和失活过程的影响,与其活性水平有关。 第三部分Src家族成员Src对螺旋神经节神经元电压门控性钠通道的作用 研究目的：观察Src对SGN电压门控性钠通道电生理特性的影响,明确Src家族单个成员在调节SGN电压门控性钠通道过程中所起的作用。 研究方法：利用全细胞记录膜片钳技术,通过细胞内给药途径,观察Src特异抑制剂Src40-58对SGN INa,钠电流宏观激活和失活,I-V曲线,电导,激活曲线,稳态失活曲线以及失活后恢复曲线的作用。并观察PP2预处理后,Src40-58对SGN INa作用的变化。 结果： (1) Src40-58(0.3mg/ml)抑制SGN INa,INa为给药前73.8±3.5%(n=10,P<0.05)。Src40-58还抑制I-V曲线峰值,但不影响反转电位。 (2)Src40-58不影响SGN INa的宏观激活和失活。 (3)Src40-58抑制SGN钠通道的电导,作用前后钠通道的电导分别为(12±2.5)nS和(10±3)nS(n=7,P<0.05)。 (4)Src40-58作用前后,钠通道半激活电压(V1/2)分别为(-38.5±0.4)mV和(-44.3±0.6)mV,斜率K为(3.8±0.4)和(3.2±0.5)(n=7,P<0.05)；而钠通道半失活电压(V1/2)分别为(-63.4±0.4)mV和(-67.9±0.5)mV,斜率K为(6.54±0.4)和(7.36±0.4)(n=9,P<0.05),钠通道的激活曲线和失活曲线均移向超极化方向。 (5)Src40-58影响SGN钠通道的失活后恢复曲线。Src40-58作用前后,钠通道的失活后恢复时间常数分别为(1.1±0.5)和(1.7±0.7)ms(n=6, P<0.05), Src40-58延缓SGN钠通道的失活后恢复过程。 (6)10μM PP2预处理5min,然后给予Src40-58,SGN INa为给药前96.5±11.7%(n=10,P>0.05),此时Src40-58不影响INa的大小,也不影响I-V曲线峰值和反转电位。 (7)PP2预处理后可阻断Src40-58对SGN钠通道的电导的抑制作用,作用前后钠通道的电导分别为(8±0.9)nS和(7.5±1.2)nS(n=7,P>0.05)。 (8)同理,PP2预处理后,Src40-58作用前后SGN钠通道的半失活电压(V1/2)分别为(-71.2±0.4)mV和(-73.3±0.4)mV,斜率K为(6.7±0.4)和(7.1±0.3)(n=8,P>0.05),稳态失活曲线未出现明显位移。而半激活电压(V1/2)分别为(-33.8±0.5)mV和(-39.9±1)mV,斜率K为(3.7±0.7)和(4.8±0.8)(n=9,P<0.05),钠通道的激活曲线仍移向超极化方向。 (9)同理,PP2预处理后阻断Src40-58对SGN钠通道的失活后恢复曲线的影响。Src40-58作用前后,钠通道的失活后恢复时间常数分别为(7±4.6)和(7.4±4.6)ms(n=6,P>0.05)。 结论：Src对SGN钠通道的具有与Src家族类似的抑制作用,主要通过抑制电导大小,增强其电压依赖性稳态失活过程,延缓失活后恢复过程。