聚合酶链反应中抑制物的检测及去除方法研究

目的：恶性淋巴瘤一直是病理诊断的难点。PCR以其快速、灵敏、易于操作等优点成为众多领域的首选技术。近年来，PCR检测基因重排已经成为淋巴瘤诊断不可缺少的手段。然而，假阴性一直是困扰PCR结果的问题之一。尤其是由于PCR抑制物的存在，常常导致PCR出现假阴性结果，影响淋巴瘤的正确诊断。目前，关于抑制物问题，国内尚未见系统研究。因此，如何检出DNA模板中抑制物的存在，通过必要的方法使之去除，同时探究导致PCR假阴性的其他因素，改进固定、DNA提取以及PCR反应中的不适环节，从而提高基因重排的阳性率，成为本课题研究的重点内容。 方法：(1)构建一含有β-globin基因片段的重组质粒，作为检测DNA提取物中是否含有PCR抑制物的内对照，在PCR反应中作为目的基因扩增的模板。选取以淋巴组织为主的新鲜及石蜡组织进行分组，有目的地对新切蜡片和陈旧蜡片设立对照，常规PCR筛查阴性标本，加入内对照体系检测抑制作用的有无。(2)以淋巴瘤细胞系DG75细胞DNA作为PCR反应的模板，选择固定、包埋、HE染色以及消化裂解法、酚／氯仿抽提法提取DNA过程中所用化学试剂10％福尔马林，95％乙醇，二甲苯，苏木素，伊红，Tris.HCl，EDTA，苯酚，氯仿，2％SDS，分别取1μl倍比稀释为1∶10，1∶50，1∶100，1∶1000四个浓度梯度，取原液及上述4个浓度溶液各1μl加入PCR反应体系中，观察不同试剂不同浓度对PCR反应的影响。(3)采用10％福尔马林、95％乙醇、中性缓冲福尔马林、 4%多聚甲醛一O.IM磷酸缓冲液(pH7.3)作为固定剂，0.IM PBS作为对 照组。收集新鲜扁桃体组织16例，每一标本水平剖开，面积2.5 X 1.scm， 及时冰冻切取4阳厚切片共25份，进行4h、12h、24h、72h、120h五 个不同时段的固定，消化法提取DNA，作为PCR的模板，进行看家基因 p一globin的扩增。比较OD26。二/OD:。。二比值、DNA浓度、PCR结果，进行 统计学分析，选出最适固定剂和固定时间。(4)将第一部分实验中p 一globin检测阴性的DNA提取物，分别进行如下处理:加热、稀释、BSA 孵育，Ba顽工、Ec0RI、HindIH内切酶消化，观察各种方法对阴性标本 的处理效果，找出合适的处理方法，为淋巴瘤基因重排检测提供较为可 靠的技术保证。 结果:(1)27例新鲜组织DNA提取物经PCR扩增后，p一globin 基因扩增阳性率88.9%(24/27);65例石蜡组织DNA提取物经PCR扩增 后，p一globin基因扩增阳性率78.5%(51/65)。两者比较，P>0.05， 统计无显著性差异。但新切淋巴瘤组织扩增阳性率89.3ry0(25/28);高 于陈旧淋巴瘤切片扩增阳性率40%(6/15)，尸<0.01，二者存在显著性 差异。17例扩增阴性的标本中，13例抑制了p一globin重组质粒的扩增， 占76.5%。(2)化学试剂10%福尔马林、苏木素、伊红、EDTA、苯酚、 氯仿、2%SDS对PCR存在抑制作用，而95%乙醇、Tri 5.HCI、二甲苯在 上述浓度范围内时对PCR影响不大。(3)对于新鲜淋巴组织基因片段的 扩增，以95%乙醇固定效果最佳，其余三组固定剂随固定时间的延长， PCR阳性率逐渐降低。尤其是经10%福尔马林固定超过72h，标本中容易 产生PCR抑制成分。(4)经过各种方法的处理，14例阴性标本扩增出了 p一globin目的片段，总有效率为82.4%。对17例阴性标本处理后，PCR 阳性率分别为:加热法23.53%，稀释法64.71%，BSA法82.35%、Ba洲 I法52.94%，EcoRI法35.29%，Hindlll35.29%，各阳性率比较只0.01。 结论:(1)抑制物的存在是导致PCR假阴性的主要原因;(2)某些 试剂10%福尔马林、苏木素、伊红、EDTA、苯酚、氯仿、2%SDS的微量 存在，抑制了目的基因的扩增;(3)经10%福尔马林(A)、95ry0乙醇(B)、 中性缓冲福尔马林(C)、4%多聚甲醛一O.IM磷酸缓冲液(D)4种固定 剂及0.IMPBS液(E)固定4h、12h、24h、72h、120h不同时段，分析 发现，95%乙醇固定效果最好，100k福尔马林固定时间以不超过72h为 宜;(4)对阴性标本的处理，以BSA法效果最好。