CB1受体参与电针镇痛作用的机制

背景： 在临床就诊患者中，与疼痛相关的疾病占有80%的比例。疼痛可引起强烈的应激反应，延缓机体恢复和伤口愈合，严重影响生活质量。因此适当、有效的镇痛在病人的早期恢复中具有重大的意义，对于患者功能恢复、死亡率的降低发挥着重要作用。然而现有的镇痛方法不是缺乏足够的有效性就是伴随着严重的毒副作用。电针作为祖国传统医学的瑰宝，具有安全可靠、简便易行等优点，其镇痛作用已被全世界认可，广泛应用于术后痛、腰痛、头疼、关节疼痛等急性和慢性疼痛的治疗中。通过不断的研究，人们对电针镇痛的中枢机制已有了初步的了解，证实了内源性阿片肽系统、谷氨酸及其受体、γ-氨基丁酸受体等均参与介导了电针镇痛作用。但现有的研究结果并未完全揭示电针镇痛的完整机制，如介导镇痛产生的特定细胞亚群，电针刺激作用激活的中枢神经系统具体靶区域等。深入研究电针镇痛的机制，对其临床应用具有重要的指导意义，同时也有助于祖国传统医学在国际范围内的进一步推广和应用。研究表明，CB1受体广泛分布于痛觉传导通路中，在中枢神经系统痛觉信号的调节中具有重要作用。我们之前的研究结果显示，电针刺激能够通过激活中枢神经系统CB1受体诱导产生脑缺血耐受，这提示，CB1受体可能参与介导了电针的镇痛效应。而以往研究证实，CB1受体存在于不同类型神经元中（如谷氨酸能神经元和GABA能神经元），系统性甚至是局部CB1受体活性的改变都能够对其靶细胞CB1受体信号传导产生网络式影响，并作用于多种细胞和组织，最终表现出复杂的功能表型，很难分辨出这样的表型是哪些特异的细胞所产生的直接作用的总和。因此，我们率先应用Cre/LoxP系统建立起不同的细胞特异性CB1受体基因敲除小鼠，实现对不同神经元亚群CB1受体在电针镇痛作用机制中的靶向研究，为进一步阐明电针镇痛的中枢机制提供结构与功能证据。 第一部分 CB1受体参与低频电针诱导的镇痛作用 目的 分别使用CB1受体拮抗剂和CB1-KO小鼠研究CB1受体是否参与低频和高频电针镇痛作用。 方法 1制动及针灸针刺入和留置对C57BL/6N小鼠甩尾潜伏期的影响 健康雄性C57BL/6N小鼠（体重23～28g）4只，放入制动器中并置入针灸针（未施与电刺激），经过60min的适应期后，行TFL基线测定，随后每隔10min检测一次小鼠甩尾潜伏期，持续30min。 2CB1受体拮抗剂对低频电针镇痛作用的影响 健康雄性C57BL/6N小鼠（体重23～28g）20只，随机分为2组，溶剂组（Ve）（n=12）和利莫那班组（SR）（n=8）。两组动物被放入制动器并置入针灸针（未施与电刺激）后腹腔注射利莫那班3mg/kg或其溶剂，于给药后60min测定TFL基线并给予双侧足三里和三阴交2Hz电针刺激30min。在电针开始后每隔10min检测一次小鼠甩尾潜伏期，检测时，将电针刺激仪暂时关闭。 3CB1受体拮抗剂对高频电针镇痛作用的影响 健康雄性C57BL/6N小鼠（体重23～28g）14只，随机分为2组，溶剂组（Ve）（n=8）和利莫那班组（SR）（n=6）。两组动物被放入制动器并置入针灸针（未施与电刺激）后腹腔注射利莫那班3mg/kg或其溶剂，于给药后60min测定其TFL基线并给予双侧足三里和三阴交100Hz电针刺激30min。在电针开始后每隔10min检测一次小鼠甩尾潜伏期，检测时，将电针刺激仪暂时关闭。 4低频电针对CB1-KO小鼠甩尾潜伏期的影响 健康雄性CB1受体基因敲除小鼠（CB1-KO）（n=7）及其野生型同窝鼠（wild-typelittermates，WT）（n=9）（体重23～28g）被放入制动器并置入针灸针（未施与电刺激）60min后测定TFL基线并给予双侧足三里和三阴交2Hz电针刺激30min，在电针开始后每隔10min检测一次小鼠甩尾潜伏期，检测时，将电针刺激仪暂时关闭。 5高频电针对CB1-KO小鼠甩尾潜伏期的影响 健康雄性CB1受体基因敲除小鼠（CB1-KO）（n=8）及其野生型同窝鼠（WT）（n=6）（体重23～28g）被放入制动器并置入针灸针（未施与电刺激）60min后测定TFL基线并给予双侧足三里和三阴交100Hz电针刺激30min，在电针开始后每隔10min检测一次小鼠甩尾潜伏期，检测时，将电针刺激仪暂时关闭。 结果 1制动及针灸针刺入和留置不影响C57BL/6N小鼠甩尾潜伏期 与TFL基线值相比，各时间点TFL变化百分比均无显著性差异。 2CB1受体拮抗剂逆转低频电针诱导的镇痛作用 与TFL基线值相比，电针开始后，Ve组TFL持续上升，至电针刺激结束时，TFL升高达峰值。SR组电针过程中TFL变化百分比显著低于Ve组。 3CB1受体拮抗剂不影响高频电针诱导的镇痛作用 与TFL基线值相比，电针开始后，SR组和Ve组TFL均持续上升，至电针结束时，TFL升高达峰值。SR组电针过程中TFL变化百分比与Ve组相比无显著性差异。 4低频电针对CB1-KO小鼠不具有镇痛作用 与TFL基线值相比，电针开始后，WT组TFL持续上升，至电针结束时，TFL升高达峰值。而CB1-KO组小鼠在电针刺激过程中各时间点TFL与基线值相比均无显著变化。CB1-KO组TFL变化百分比显著低于WT组。 5高频电针对CB1-KO小鼠具有镇痛作用 与TFL基线值相比，电针开始后，KO组和WT组TFL均持续上升，至电针结束时，TFL升高达峰值。KO组TFL变化百分比与WT组相比无显著性差异。 结论 小鼠双侧足三里和三阴交穴位低频和高频电针均能够诱导产生显著的镇痛效应，且低频电针诱导的镇痛作用是通过CB1受体介导的，而高频电针的镇痛作用则是非CB1受体依赖的。 第二部分 大脑皮质谷氨酸能神经元CB1受体介导低频电针镇痛作用 目的 应用不同品系条件性CB1受体基因敲除小鼠探讨表达于不同类型神经元的CB1受体在低频电针镇痛效应中的作用，以明确介导低频电针镇痛作用的CB1受体所处的具体神经元亚群。 方法 1制动及针灸针刺入和留置对基因敲除小鼠甩尾潜伏期的影响 健康雄性Glu/GABA-CB1-KO小鼠（n=4）及其野生型同窝鼠（WT）（n=4）（体重23～28g）被放入制动器并置入针灸针（未施与电刺激），经过60min的适应期后，行TFL基线测定，随后每隔10min检测一次小鼠甩尾潜伏期，持续30min。 2低频电针对CaMK-CB1-KO小鼠甩尾潜伏期的影响 健康雄性CaMK-CB1-KO小鼠（CaMK-CB1-KO）（n=6）及其野生型同窝鼠（WT）（n=7）（体重23～28g）被放入制动器并置入针灸针（未施与电刺激）60min后测定TFL基线值，随后给予双侧足三里和三阴交2Hz电针刺激30min，在电针开始后每隔10min检测一次小鼠甩尾潜伏期，检测时，将电针刺激仪暂时关闭。 3低频电针对Glu-CB1-KO小鼠甩尾潜伏期的影响 健康雄性Glu-CB1-KO小鼠（n=8）及其野生型同窝鼠（WT）（n=7）（体重23～28g）被放入制动器并置入针灸针（未施与电刺激）60min后测定TFL基线值，随后给予双侧足三里和三阴交2Hz电针刺激30min，在电针开始后每隔10min检测一次小鼠甩尾潜伏期，检测时，将电针刺激仪暂时关闭。 4低频电针对Glu/GABA-CB1-KO小鼠甩尾潜伏期的影响 健康雄性Glu-CB1-KO小鼠（n=10）， GABA-CB1-KO小鼠（n=9），GABA/Glu-CB1-KO小鼠（n=7），及其野生型同窝鼠（WT）（n=9）（体重23～28g）被放入制动器并置入针灸针（未施与电刺激）60min后测定TFL基线值，随后给予双侧足三里和三阴交2Hz电针刺激30min，在电针开始后每隔10min检测一次小鼠甩尾潜伏期，检测时，将电针刺激仪暂时关闭。 5低频电针对D1-CB1-KO小鼠甩尾潜伏期的影响 健康雄性D1-CB1-KO小鼠（n=5）及其野生型同窝鼠（WT）（n=6）（体重23～28g）被放入制动器并置入针灸针（未施与电刺激）60min后测定TFL基线值，随后给予双侧足三里和三阴交2Hz电针刺激30min，在电针开始后每隔10min检测一次小鼠甩尾潜伏期，检测时，将电针刺激仪暂时关闭。 结果 1制动及针灸针刺入和留置不影响基因敲除小鼠甩尾潜伏期 与TFL基线值相比，各时间点TFL变化百分比均无显著性差异。 2低频电针对CaMK-CB1-KO小鼠无镇痛作用 与TFL基线值相比，电针开始后，WT组TFL持续上升，至电针结束时，TFL升高达峰值。而CaMK-CB1-KO组小鼠在电针刺激过程中各时间点TFL与基线值相比均无显著变化。CaMK-CB1-KO组TFL变化百分比显著低于WT组。 3低频电针对Glu-CB1-KO小鼠无镇痛作用 与TFL基线值相比，电针开始后，WT组TFL持续上升，至电针结束时，TFL升高达峰值。而Glu-CB1-KO组小鼠在电针刺激过程中各时间点TFL与基线值相比均无显著变化。Glu-CB1-KO组TFL变化百分比显著低于WT组。 4低频电针对Glu/GABA-CB1-KO和Glu-CB1-KO小鼠无镇痛作用，对GABA-CB1-KO小鼠的镇痛作用低于野生型小鼠 与TFL基线值相比，电针开始后，WT组和GABA-CB1-KO组TFL持续上升，至电针结束时，TFL升高达峰值。而Glu/GABA-CB1-KO和Glu-CB1-KO组小鼠在电针刺激过程中各时间点TFL与基线值相比均无显著变化。电针结束时，GABA-CB1-KO组TFL变化百分比低于同时间点WT组，高于同时间点Glu/GABA-CB1-KO和Glu-CB1-KO组。 5低频电针对D1-CB1-KO小鼠具有镇痛作用 与TFL基线值相比，电针开始后，WT组和D1-CB1-KO组TFL均持续上升，至电针结束时，TFL升高达峰值。D1-CB1-KO组小鼠在电针刺激过程中TFL变化百分比与WT组相比无显著性差异。 结论 本实验首先通过使用CaMK-CB1-KO小鼠证实前脑主要神经元上的CB1受体在低频电针诱导镇痛效应中具有决定性作用，随后又分别使用Glu-CB1-KO小鼠、Glu/GABA-CB1-KO小鼠和D1-CB1-KO小鼠进一步研究介导低频电针镇痛作用的CB1受体的神经元亚群特异性，并最终证实低频电针镇痛作用是由谷氨酸能神经元上的CB1受体介导的。 第三部分 CB1受体依赖性谷氨酸传递的快速抑制参与低频电针的镇痛作用 目的 应用无效剂量NMDA受体抑制剂MK-801观察CB1受体依赖性兴奋性谷氨酸传递的快速抑制在谷氨酸能神经元CB1受体介导低频电针镇痛效应中的作用。 方法 1MK-801诱导镇痛作用的剂量依赖实验 31只健康雄性WT*CB1小鼠（体重23～28g）随机分为5组，溶剂组（Ve）（n=6），0.02mg/kg MK-801组（MK0.02）（n=6），0.06mg/kg MK-801组（MK0.06）（n=7），0.18mg/kg MK-801组（MK0.18）（n=6）和0.54mg/kg MK-801组（MK0.54）（n=6），各组小鼠被放入制动器并置入针灸针（未施与电刺激），经过60min适应期后检测其TFL基线值并腹腔注射溶剂或对应剂量的MK-801，并于10min后开始每隔10min检测一次小鼠甩尾潜伏期，持续30min。 2MK-801对低频电针镇痛效应抑制作用的剂量依赖实验 41只健康雄性WT*CB1小鼠（体重23～28g）随机分为5组，溶剂组（Ve）（n=12），0.003mg/kg MK-801组（MK0.003）（n=6），0.01mg/kg MK-801组（MK0.01）（n=7），0.03mg/kg MK-801组（MK0.03）（n=8）和0.06mg/kg MK-801组（MK0.06）（n=8），各组小鼠被放入制动器并置入针灸针（未施与电刺激），经过60min适应期后检测其TFL基线值并腹腔注射溶剂或对应剂量的MK-801，10min后行2Hz电针刺激30min，并从电针开始后每隔10min检测一次小鼠甩尾潜伏期，检测时，将电针刺激仪暂时关闭。 3低剂量MK-801对CB1-KO小鼠低频电针镇痛作用的影响 49只健康雄性CB1-KO小鼠（n=25）及其野生型同窝鼠（WT）（n=24）（体重23～28g）随机分为4组，WT小鼠溶剂注射组（Vehicle+WT）（n=11），WT小鼠MK-801注射组（MK-801+WT）（n=13），CB1-KO小鼠溶剂注射组（Vehicle+CB1-KO）（n=11）和CB1-KO小鼠MK-801注射组（MK-801+CB1-KO）（n=14）。各组小鼠被放入制动器并置入针灸针（未施与电刺激），经过60min适应期后检测其TFL基线值并腹腔注射溶剂或0.003mg/kg MK-801，10min后行2Hz电针刺激30min，电针结束后检测小鼠甩尾潜伏期。 4低剂量MK-801对Glu-CB1-KO小鼠低频电针镇痛作用的影响 48只健康雄性Glu-CB1-KO小鼠（n=17）及其野生型同窝鼠（WT）（n=31）（体重23～28g）随机分为4组，WT小鼠溶剂注射组（Vehicle+WT）（n=18），WT小鼠MK-801注射组（MK-801+WT）（n=13）， Glu-CB1-KO小鼠溶剂注射组（Vehicle+Glu-CB1-KO）（n=10）和Glu-CB1-KO小鼠MK-801注射组（MK-801+Glu-CB1-KO）（n=7）。各组小鼠被放入制动器并置入针灸针（未施与电刺激），经过60min适应期后检测其TFL基线值并腹腔注射溶剂或0.003mg/kgMK-801，10min后行2Hz电针刺激30min，电针结束后检测小鼠甩尾潜伏期。 结果 1高剂量MK-801（0.54mg/kg）诱导产生显著的镇痛作用，而中等剂量MK-801（0.06mg/kg）则无镇痛作用 与TFL基线值相比，MK0.54组TFL变化百分比在给予MK-801后30min开始上升，至40min时显著升高；其余4组各时间点TFL变化百分比与TFL基线值相比均无显著性变化。 2中等剂量MK-801（0.06mg/kg）逆转了低频电针镇痛作用，而低剂量MK-801（0.003mg/kg）则对低频电针镇痛作用无影响 与TFL基线值相比，Ve组、MK0.003组、MK0.01组和MK0.03组电针开始后TFL变化百分比显著升高，至电针结束时达峰值，而MK0.06组电针开始后TFL与基线值相比无显著性变化，TFL变化百分比显著低于Ve组。MK0.003组、MK0.01组和MK0.03组TFL变化百分比虽然与Ve组相比无显著性变化，但在EA2和EA3时间点0.03MK组和0.01MK组TFL变化百分比均低于Ve组。 3低剂量MK-801（0.003mg/kg）恢复了在CB1-KO小鼠缺失的低频电针镇痛作用 与TFL基线值相比，电针结束后Vehicle+WT组、MK-801+WT组和MK-801+CB1-KO组TFL变化百分比显著升高，而Vehicle+CB1-KO组TFL变化百分比无显著性变化。Vehicle+CB1-KO组TFL变化百分比显著低于Vehicle+WT组，且MK-801与CB1-KO/WT基因型之间存在显著的相关性。 4低剂量MK-801（0.003mg/kg）恢复了在Glu-CB1-KO小鼠缺失的低频电针镇痛作用 与TFL基线值相比，电针结束后Vehicle+WT组、MK-801+WT组和MK-801+Glu-CB1-KO组TFL变化百分比显著升高，而Vehicle+Glu-CB1-KO组TFL变化百分比无显著性变化。Vehicle+Glu-CB1-KO组TFL变化百分比显著低于Vehicle+WT组，且MK-801与Glu-CB1-KO/WT基因型之间存在显著的相关性。 结论 高剂量MK-801（0.54mg/kg）具有显著的镇痛效应，中等剂量MK-80（10.06mg/kg）逆转了低频电针诱导的镇痛效应，而低剂量MK-801（0.003mg/kg）则恢复了在CB1-KO和Glu-CB1-KO小鼠消失的低频电针镇痛效应。这表明CB1受体依赖性兴奋性谷氨酸传递的快速抑制是谷氨酸能神经元CB1受体介导低频电针镇痛效应的下游机制。 第四部分 PAG参与谷氨酸能神经元CB1受体介导的低频电针镇痛作用 目的 应用c-fos免疫荧光染色确定低频电针激活的主要脑区以及该区域的激活是否是由来自皮质谷氨酸能神经元投射末端突触前膜CB1受体调节的。 方法 1低频电针诱导PAG区域c-fos表达变化 9只健康雄性WT*CB1小鼠（体重23～28g）随机分为3组，对照组（home cage，HC）（n=3），制动对照组（immobilization，IM）（n=3）和EA组（n=3）。HC组在经心脏灌注前未进行任何处理，IM组和EA组小鼠被放入制动器并置入针灸针（未施与电刺激），经过60min适应期后继续单纯制动或给予2Hz电针刺激，持续30min，结束后放回鼠笼，90min后行经心脏灌注。 2谷氨酸能神经元CB1受体对低频电针诱导c-fos表达上调的影响 健康雄性Glu-CB1-KO小鼠（n=12）及其野生型同窝鼠（wild-type littermates，WT）（n=13）（体重23～28g）随机分为4组，WT小鼠制动组（WT+IM）（n=7），WT小鼠电针组（WT+EA）（n=6），Glu-CB1-KO小鼠制动组（Glu-CB1-KO+IM）（n=5）和Glu-CB1-KO小鼠电针组（Glu-CB1-KO+EA）（n=7）。各组小鼠均放入制动器并置入针灸针（未施与电刺激），经过60min适应期后继续单纯制动或给予2Hz电针，持续30min，结束后放回鼠笼，90min后行经心脏灌注。 结果 1低频电针诱导vlPAG区域c-fos表达增加 EA组vlPAG区域c-fos表达最高，且EA组c-fos表达显著高于HC组和IM组，HC组c-fos表达非常微弱。 2低频电针诱导的c-fos表达增加在Glu-CB1-KO小鼠头侧vlPAG区域消失 各组vlPAG区域c-fos表达均显著高于同组lPAG、dlPAG和dmPAG区域。vlPAG头侧水平WT+EA组c-fos表达显著高于其余各组，其余各组间c-fos表达无显著性差异，且EA处理与Glu-CB1-KO/WT基因型之间存在显著的相关性。 结论 低频电针能够诱导vlPAG区域c-fos表达增加，且c-fos表达的增高在Glu-CB1-KO小鼠头侧vlPAG区域消失，提示低频电针诱导的头侧vlPAG区域的激活是由来自皮质谷氨酸能神经元投射末端突触前膜CB1受体调节的。 小结 1. CB1受体参与了低频电针诱导的镇痛作用。 2.低频电针诱导的镇痛作用是由大脑皮质谷氨酸能神经元CB1受体介导的。 3. CB1受体依赖性兴奋性谷氨酸传递的快速抑制是谷氨酸能神经元CB1受体介导低频电针镇痛作用的下游机制。 4. vlPAG是参与介导低频电针镇痛作用的重要脑区之一。 5.低频电针诱导的vlPAG区域的激活是由来自皮质谷氨酸能神经元投射末端突触前膜CB1受体调节的。