黄芩苷对2型糖尿病糖脂代谢的影响及机制研究

背景:2型糖尿病是一种由于胰岛素抵抗,或同时伴有胰岛素相对不足而引起的以慢性高血糖为主的代谢综合征,占糖尿病总体人群的90%-95%。黄芩苷作为从传统中药黄芩中提取的一种黄酮类单体化合物,在综合治疗2型糖尿病及其并发症方面具有广阔前景。目的:本课题通过建立两种2型糖尿病小鼠模型:胰岛素抵抗模型和胰岛素抵抗伴有胰岛素缺陷模型,研究黄芩苷对2型糖尿病不同发病时期糖脂代谢的影响及其分子机制,为开发综合治疗2型糖尿病等代谢性疾病的药物提供实验依据。方法:将C57BL/6J雄性小鼠随机分为正常饮食组(ND)和模型组。模型组给予高脂及高脂联合链脲佐菌素(STZ)诱导,建立2型糖尿病小鼠模型。模型成功后,将模型小鼠分为:高脂对照组(HFD)、高脂+黄芩苷组(HFD+B)、高脂+STZ组(HFD+STZ)、高脂+STZ+黄芩苷组(HFD+STZ+B),每组10只。其中治疗组给予黄芩苷治疗16周,对照组给予等体积蒸馏水。给药期间进行糖耐量和胰岛素耐量试验。实验结束后,采用全自动生化仪测定小鼠甘油三脂、总胆固醇、谷丙转氨酶、肌酸激酶等生化指标;ELISA法测定小鼠血清胰岛素、游离脂肪酸;分离小鼠肝脏、骨骼肌、胰腺组织进行H&E染色、油红O染色或免疫组化染色,观察组织形态及病理学变化;应用Western blot分别检测小鼠肝脏和骨骼肌AMPK、ACC、Akt、GSK-3β蛋白及其磷酸化形式的表达。细胞水平上,通过高糖(25mM)环境诱导HepG2细胞建立肝胰岛素抵抗模型,Western blot检测AMPK、ACC、Akt、GSK-3β蛋白水平以确定黄芩苷的最佳作用时间及作用浓度;MTT法检测黄芩苷对HepG2细胞的活力及毒性影响;采用AMPK的抑制剂、激动剂(Compound C、AICAR)及 Akt 的抑制剂、激动剂(LY294002、Insulin),Western blot检测蛋白表达来观察AMPK信号通路和胰岛素信号通路的相互影响,以及对葡萄糖消耗的影响。结果:(1)黄芩苷能有效降低HFD及HFD+STZ两种2型糖尿病模型小鼠的空腹血糖、血脂(甘油三脂、总胆固醇、低密度脂蛋白、游离脂肪酸)、肝湿重,并改善体重、糖耐量异常和胰岛素耐量异常。对HFD组小鼠,黄芩苷能够明显降低血清胰岛素水平改善高胰岛素血症状态;对HFD+STZ组小鼠,黄芩苷能够促进胰岛素分泌,改善胰岛素缺陷状态。表明黄芩苷对2型糖尿病不同时期的病理状态都有较好的改善作用。(2)肝脏、骨骼肌的H&E和油红O染色显示:HFD+STZ组小鼠的肝脏、骨骼肌的脂质沉积及脂肪变性较HFD组小鼠严重,而黄芩苷(200mg/kg/d)均能有效减少两种模型小鼠的肝脏、骨骼肌的脂质积累,改善脂质沉积状况。同时,黄芩苷还能显著提高两种模型小鼠的肝脏、骨骼肌的AMPK、ACC、Akt、GSK3β蛋白的磷酸化水平。胰腺及胰岛p细胞的H&E染色和免疫组化染色显示:黄芩苷能显著改善胰岛功能,改善胰岛病理形态及面积。(3)黄芩苷能有效降低HFD组及HFD+STZ组小鼠诱导的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酸激酶、尿素氮及血肌酐含量(P<0.05),心肝肾毒性小,有一定的组织保护作用。(4)细胞水平上,在0.1-50μM浓度范围内,黄芩苷对HepG2细胞无细胞毒性影响;且黄芩苷1μM浓度作用1h,能显著提高AMPK、ACC、Akt、GSK3β的磷酸化水平,抑制脂肪酸合成且促进糖原生成。抑制剂实验表明,黄芩苷可通过AMPK分子调节GSK3β的活性,需要胰岛素信号通路Akt的参与;同时,Akt/GSK3β的活化也能间接抑制AMPK信号通路的活性。结论:黄芩苷能够有效改善两种2型糖尿病模型小鼠的高血糖、高血脂,及胰岛素水平,其机制可能与调节肝脏和骨骼肌的AMPK/Akt/GSK3β信号通路有关。黄芩苷还能改善胰岛素抵抗和胰岛功能,促进肝脏和骨骼肌对胰岛素的敏感性,刺激胰岛素的分泌。通过对黄芩苷治疗2型糖尿病的综合研究,为今后深入开发黄芩苷及新型的治疗2型糖尿病和其他代谢疾病的药物提供实验依据。