植物乳杆菌ST-Ⅲ全基因组序列分析及其对低聚果糖代谢通路的解析

低聚果糖（FOS）是指2-10个果糖基为链节，以β(2-1)或β(2-6)糖苷键连接形成的碳水化合物聚合物。作为一种常用的益生元，FOS具有选择性地促进肠道中乳杆菌和双歧杆菌生长从而显著改善肠道菌群平衡的功能。尽管FOS的益生功能已被大量体内和体外研究证实，然而乳酸菌对FOS的代谢通路及其具体机制尚未阐明。本论文以植物乳杆菌ST-III为研究对象，基于系统生物学策略描述植物乳杆菌ST-III代谢FOS的生物反应过程及其调控机制，包括利用基因组学和转录组学方法分析植物乳杆菌代谢FOS通路，确定关键基因并了解代谢过程中产物和菌体的变化。论文的主要研究结果如下： （1）采用Roche454和Illumina Solexa两种高通量测序技术相结合的方法完成了植物乳杆菌ST-III全基因组的测序工作。植物乳杆菌ST-III基因组由一个大小为3,254,376bp染色体和一个大小53,560bp的质粒组成，分别含有3,014和42个编码序列。采用比较基因组学分析和比较了植物乳杆菌ST-III基因组特点：一方面，植物乳杆菌ST-III基因组含有植物乳杆菌核心基因和代谢通路，未发现任何致病基因；另一方面，植物乳杆菌ST-III基因组表现出许多与另外几株不同的特点，如编码降胆固醇相关基因等。此外，植物乳杆菌ST-III基因组中与低聚糖代谢相关基因簇伴有编码冗余现象，特别是发现多个潜在代谢FOS的功能基因。 （2）利用生物信息学方法对植物乳杆菌ST-III内源质粒pST-III序列进行系统分析并对其相关性质进行测定。根据复制蛋白的同源性及复制起始位点的典型特征，推测pST-III属于θ型复制质粒。在pST-III的42个基因中，33个被赋予潜在的生物学功能，特别是在乳杆菌属中首次发现一个kdp基因簇编码高亲和力钾离子转运系统；此外该质粒还编码一个甘氨酸/胆碱/肉碱转运系统。质粒编码功能分析和质粒消除实验证明pST-III对于宿主的渗透压耐受性有很大的贡献。 （3）利用RNA-seq技术对植物乳杆菌ST-III分别以FOS和葡萄糖为唯一碳源培养到生长初期的菌体的全部基因表达水平差异进行测定。植物乳杆菌ST-III利用FOS与葡萄糖相比，共发现363个基因差异表达，其中324个基因上调，39个基因下调。特别是发现两个大小分别为7.5kb和4.5kb的基因簇可能参与FOS的代谢。运用基因敲除手段对上述基因簇中编码β-果糖苷酶（SacA）和PTS转运系统（SacPTS1和SacPTS2）的基因进行缺失，发现在植物乳杆菌ST-III中，FOS是通过SacPTS1和SacPTS2系统转运进胞内后，被SacA水解成单糖。通过转录组实验、细胞膜脂肪酸的检测及膜流动性的测定，表明植物乳杆菌ST-III在利用FOS时会下调有关脂肪酸合成基因，从而改变脂肪酸组成导致脂肪酸链长的缩短，最终提高膜流动性以保证FOS转运与利用。转录组分析发现FOS会诱导植物乳杆菌ST-III中与乙酸合成有关的基因显著上调；而代谢产物分析结果同样显示，植物乳杆菌ST-III利用FOS会使得代谢产物中乙酸含量增加。 （4）对植物乳杆菌ST-III代谢FOS的关键酶——β-果糖苷酶进行了序列分析。果糖苷酶基因sacA编码501个氨基酸，相对分子质量为56,695Da。序列比对结果表明SacA酶含有GH32家族蛋白保守的结构域，如NDPNG，RDP和EC，因而证明SacA是GH32家族蛋白成员之一。根据构建的同源模型，SacA含有典型的β-螺旋桨结构、β-三明治结构和特殊的α-螺旋结构。将sacA基因克隆到大肠杆菌中，对重组蛋白的酶学性质进行研究。重组SacA酶的最适温度为37℃，最适pH为6.0，在低温下较稳定，酶活受到Ag+、Cu2+和Hg2+的显著抑制。根据对糖苷键水解位点的分析，SacA酶是通过外切的方式水解底物中的β(2-1)糖苷键，从底物非还原端释放果糖残基。酶动力学实验表明该酶的最适底物是蔗果三糖。为了验证SacA酶的功能，将sacA基因在不能利用果糖的鼠李糖乳杆菌LGG中异源表达，结果显示得到的重组菌获得了利用FOS的能力。