北柴胡皂苷合成相关P450、UGT基因的筛选、克隆及遗传转化初步研究

北柴胡Bupleurum chinense DC是中药柴胡的重要基源植物,柴胡皂苷是其主要药效成分。细胞色素P450酶(cytochrome P450; P450)和糖基转移酶(uridine diphosphate (UDP) glycosyltransferase; UGT)是柴胡皂苷生物合成途径的后修饰酶,其后修饰作用是形成柴胡皂苷结构多样性的主要因素。课题组前期通过北柴胡转录组测序,得到了246个P450独立基因和102个GT独立基因(其中49个UGT)。本研究在此基础上对其中14个P450基因和20个UGT基因进行了筛选,得到可能参与柴胡皂苷生物合成的2个P450基因和3个UGT基因；对其中一个P450基因和两个UGT基因进行了全长克隆和载体构建,并建立了北柴胡花药愈伤组织高效再生体系,进行了根癌农杆菌介导的北柴胡遗传转化初步研究,为下一步功能验证并最终阐明柴胡皂苷生物合成途径奠定了基础。具体研究结果如下： 1.从北柴胡454测序并注释得到的独立基因中选取14个P450基因和20个UGT基因,通过荧光定量分析它们的茉莉酸甲酯(MeJA)诱导表达特性和组织表达特性,最终筛选出与p-香树脂合酶(EC5.4.9.9., β-amyrin synthase, β-AS)基因共表达的2个P450基因(P450-7和P450-12)和3个UGT基因(UGT-3、UGT-5和UGT-15),初步确定这2个P450基因和3个UGT基因可能参与北柴胡中柴胡皂苷生物合成。 2.利用LD-PCR方法克隆了可能参与柴胡皂苷生物合成的细胞色素P450基因P450-7全长cDNA,命名为BcCYP87E,其开放阅读框(ORF)1473bp,编码490个氨基酸。根据其ORF序列,设计含有酶切位点的PCR引物,扩增、酶切后插入到双元载体pCAMBIA-SUPER1300中,构建了这一基因的过量表达转基因载体。 3.通过RACE和LD-PCR方法扩增可能参与柴胡皂苷生物合成的UGT基因UGT-3全长cDNA,命名为BcUGT10,其ORF长1365bp,编码454个氨基酸。设计含有酶切位点的PCR引物,PCR扩增BcUGT10的ORF和部分片段后,酶切,分别插入到pCAMBIA-SUPER1300和pHANNIBAL中。重组的pHANNIBAL经Not I酶切后插入到pART27中。最终构建出过表达和抑制表达的转基因载体。 4.通过RACE和LD-PCR方法扩增可能参与柴胡皂苷生物合成的UGT基因UGT-15,命名为BcUGT8,该基因ORF长1335bp,编码444个氨基酸。预测了该蛋白质的结构域、业细胞定位和三维结构。同时设计含有酶切位点的PCR引物,PCR扩增其ORF,酶切后,插入到pET-28a (+)载体中,构建出原核表达载体。 5.以花粉发育处于单核期的北柴胡花药为外殖体诱导出愈伤组织,愈伤组织经多次继代培养后,置于20种含不同植物激素的分化培养基上诱导分化。结果在MS+KT0.5mg/L+蔗糖30g/L+植物凝胶5g/L培养基上分化率最高,为60%；其次为MS+ZT1.0mg/L+蔗糖30g/L+植物凝胶5g/L,为58%。再生芽在生根培养基MS+蔗糖30g/L+植物凝胶5g/L和1/2MS+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+植物凝胶5g/L中均可生根,生根率均为100%。由此建立了北柴胡花药愈伤组织高效稳定的再生体系。 6.以北柴胡不同愈伤组织或叶柄为受体,进行根癌农杆菌介导的BcCYP87E植物过量表达载体p1300-BcCYP87E转化北柴胡初步研究。经25mg/L潮霉素筛选得到抗性愈伤,并对20块抗性愈伤进行了PCR检测,未得到阳性转化愈伤,仍需进一步研究。