黄盖鹅膏肽类毒素的分离纯化及抗肿瘤活性研究

本论文在对长白山产黄盖鹅膏（Amanita subjunquillea．S．lmai），进行野外生长环境调查、子实体形态观察和不同温度PDA培养基进行菌种分离实验等生物学特性研究的基础上，主要对该菌中的肽类毒素进行分离纯化，并进行了抗肿瘤活性的研究。 生物学特性研究表明，每年8月到9月发生子实体，子实体黄色，具有菌环和菌托。子实体详细描述与杨祝良关于黄盖鹅膏的描述相同。黄盖鹅膏菌在PDA培养基不同温度培养条件下生长极其缓慢。 应用高效液相色谱法，首次对黄盖鹅膏子实体不同干燥方法的甲醇粗提物进行检测，同时对甲醇粗提物进行毒素的分离和纯化。分别用A和B两种洗脱液不同配比进行分离。A和B两种洗脱液。洗脱液A相：10％乙腈+90％0.02M醋酸铵，冰醋酸调节pH值至5.0；洗脱液B相：30％乙腈+70％0.02M醋酸铵，冰醋酸调节pH值至5.0。洗脱梯度是：0→15min，B 0→5％，A 100％→95％；15→35min，B 5→80％，A 95％→20％，；35→40min，B 80％，A．20％；40～45minB．80→100％，A 20→0％；45～50minB．100％；50→55min，B 100→0％，A 0→100％并保持10min。研究结果表明，（1）阴干和冷冻干燥的子实体的毒素含量相同，干燥方法不影响其毒素含量。（2）分离纯化得到9种化合物，经液相色谱、电喷雾质谱和核磁共振鉴定6种化合物。化合物1～6分别为：β-鹅膏毒肽、α-鹅膏毒肽、羧基三羟鬼笔毒肽、三羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽。化合物7和化合物8由于含量少，只测得分子量都为131，化合物9分子量为587，它们都不是已知的22种肽类毒素。 采用孙氏综合法，以灌胃和腹腔注射两种给药途径，对黄盖鹅膏的甲醇粗提物进行急性毒性试验。结果显示以灌胃给药，剂量为600mg／kg，观察两周未见死亡，但是右眼均失明。采用腹腔注射给药，测得半数致死量是65.4mg／kg。两种给药途径均发现粗提物使昆明小鼠的肝脏有脂肪堆积。 应用MTT法，检测黄盖鹅膏中分离的羧基三羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽分别对SGC和SMMC-7721细胞增殖的抑制作用。所有数据采用SPSS14.0统计软件进行处理，结果表明羧基三羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽，分别对SGC和SMMC-7721细胞增殖无抑制作用。 首次选用H22荷瘤小鼠，对黄盖鹅膏甲醇粗提物和二羟鬼笔毒肽进行抗肿瘤体内实验，以腹腔注射给予受试药。所有数据采用SPSS14.0统计软件进行处理，结果表明鹅膏甲醇粗提物10mg／kg／d和20mg／kg／d具有较明显的抑制作用，抑瘤率分别为41.30％和43.48％，且具有一定的量效关系，和对照组相比无显著性差异。甲醇粗提物组与5-FU组相比小鼠体重明显增加。通过对免疫器官的检测，表明甲醇粗提物对胸腺和脾有明显增重的作用，说明对免疫器官有影响。二羟鬼笔毒肽对H22荷瘤鼠的肿瘤生长具有较高的抑制作用，且存在量效关系，不同药物剂量（0.15mg／kg／d和0.3mg／kg／d）抑瘤率分别为53.03％和65.15％，且具有一定的量效关系，与对照组对比具有显著性差异（p＜0.05）。二羟鬼笔毒肽和5-FU相比体重显著增加，与对照组和5-FU对比，二羟鬼笔毒肽能明显增加H22荷瘤小鼠胸腺重量，说明对免役器官有影响。但解剖未发现器官有明显变黑现象，说明其对免疫系统负面影响较小。 总之，黄盖鹅膏甲醇粗提物应用高效液相分离纯化9种单体化合物，鉴定6种分别为β-鹅膏毒肽、α-鹅膏毒肽、羧基三羟鬼笔毒肽、三羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽。采用孙氏综合法，腹腔注射给予受试药，测得甲醇粗提物半数致死量是65.4mg／kg。体外体内抗肿瘤实验，所有数据采用SPSS14.0统计软件进行处理。结果表明，体外抗肿瘤实验单体化合物羧基三羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽，对SGC和SMMC-7721细胞增殖均无抑制作用。甲醇粗提物和单体化合物二羟鬼笔毒肽对H22荷瘤鼠有抗肿瘤活性，抑瘤率分别为43.48％和65.15％。