人参皂苷Rg1改善氧化应激引起的糖皮质激素抵抗的实验研究

背景:糖皮质激素(Glucocorticoids,GCs)在临床中发挥着重要作用,大量人工合成的GCs已广泛用于治疗自身免疫性疾病、变态反应性疾病、皮肤病和肿瘤等。GCs依赖糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)发挥其正常功能。长期大剂量应用GCs,会导致GR数量及结合力下调,机体对GCs敏感性下降,继而出现激素抵抗。目前,越来越多的学者对GCs抵抗的原因及其机制展开了深入的研究,但是到目前为止,对于GCs抵抗尚无非常有效的解决办法,虽然出现了很多糖皮质激素类替代药物,如免疫抑制剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、磷酸二酯酶4(Phosphodiesterase4,PDE4)抑制剂及细胞因子抑制剂等,但它们自身都有很大的局限性。近年来,中医药在临床中发挥着越来越重要的作用,许多学者致力于中医药改善GCs疗效的研究。人参是中医药中重要的补益药物,具有补气固脱,健脾益肺,宁心益智,养血生津等功效。人参的主要活性成分为人参总皂苷(Ginsenosides,GSS),主要由原人参二醇及人参三醇组成,具有抗炎、抗肿瘤及缓解疲劳等作用。我们前期体内外研究发现GSS能够逆转地塞米松引起的GCs敏感性降低,改善大剂量激素引起的GR减少,而且在系统性红斑狼疮的临床研究中初步证实在不影响糖皮质激素疗效的前提下,GSS有助于减少GCs用量;通过上调GR,GSS能够减轻肝动脉化疗栓塞术后发热、肝功能异常等不良反应。进一步研究发现GSS中的Rh1能够通过调节GR改善长期大剂量使用GCs后引起的激素抵抗,在体内外增加GCs的抗炎作用,同时不会引起高血糖、骨质疏松等糖皮质激素常见的副作用,但具体机制还不清楚。除了哮喘、类风湿性关节炎、COPD等疾病,GCs还在皮肤病中广泛运用。为进一步扩大人参皂苷的临床应用范围,本课题拟观察人参皂苷联合糖皮质激素在炎症类皮肤病中的应用,并探讨其可能机制。多项研究显示,人参皂苷本身具有抗氧化应激作用。预实验发现,人参皂苷Rg1和Rh1可以显著改善UVB照射引起的地塞米松(dexamethasone,DEX)抵抗,但是其改善UVB引起的氧化应激导致的GCs抵抗的具体机理尚不清楚。核因子E2相关因子2(NF-E2 related factor 2,Nrf2)是一种重要的氧化还原调节因子,其与氧化应激密切相关。在正常生理状态下,Nrf2位于细胞胞浆中,通过与它的细胞浆接头蛋白keap1结合,锚定在肌动蛋白细胞骨架;当发生氧化应激时,PI3K-Akt信号通路活化,导致Nrf2磷酸化,磷酸化的Nrf2从Keap1-Nrf2复合物中解离后进入细胞核内,并与氧化应激反应元件(ARE)结合,进而启动下游抗氧化基因如GPx、GCL及GST等的转录以对抗氧化应激损伤。Sohal SS等研究发现吸烟烟雾里含有-2-大量的氧化物质,引起机体氧化应激,下调hdac2活性,引起gcs抵抗,其机制主要是氧化应激后产生超氧化阴离子,其与硝化应激反应中生成的一氧化氮结合,生成过氧化亚硝酸盐使得hdac2上的酪氨酸残基硝化,或者激活pi3k/akt通路,使hdac2的丝氨酸残基磷酸化,导致hdac2蛋白酶体失活,使hdac2活性下降。由此我们推测,人参皂苷可能通过调节nrf2通路,抗氧化应激,提高hdac2表达及活性,增加gr的去乙酰化水平,进而上调gr,从而改善uvb引起的gcs抵抗。gss成份复杂,包含了上百种单体,仅商品化的人参皂苷单体就有40余种,如rb1、rb2、rb3、rg1、rg2、rg3、rc、rd、re、rf、ro、rh1、20(s)-rh2、20(r)-rh2、f1及f2等,这不利于其机制的研究及临床推广。前期研究中我们发现人参皂苷单体rb1、rh1、rg1及rb3均能够明显抑制dex引起的gr下调,而糖皮质激素抵抗与gr的表达密切相关。因此本研究试图从rb1、rh1、rg1及rb3这4种人参皂苷但体中筛选出改善氧化应激引起的gcs抵抗的最有效人参皂苷单体,然后进一步探讨其作用机制。目的:观察rb1、rh1、rg1及rb3这4种人参皂苷是否通过抑制氧化应激改善糖皮质激素抵抗,选出最效果最佳者并对其机制做初步探讨。方法:(一)筛选具有改善氧化应激作用的人参皂苷单体,并观察其在氧化应激状态下能否增强dex的抗炎作用。1.使用uvb和双氧水(h2o2)两种体外氧化应激模型,筛选rb1、rh1、rg1及rb3单体中改善氧自由基(reactiveoxygenspecies,ros)最明显的人参皂苷单体。2.筛选在氧化应激引起的糖皮质激素抵抗模型中,辅助dex抑制炎症因子il-6及il-8分泌的最有效的人参皂苷单体。3.结合1及2中的结果,筛选出最佳人参皂苷单体,观察其对mapks及nf-Кb炎症通路的影响。(二)探讨人参皂苷rg1改善糖皮质激素抵抗的作用机制。1.探讨rg1是否通过抑制氧化应激,抑制gr的乙酰化,进而上调gr,改善gcs抵抗。2.探讨hdac2在rg1改善氧化应激引起的糖皮质激素抵抗中的作用。3.探讨nrf2在rg1改善氧化应激引起的糖皮质激素抵抗中的作用。(三)动物实验观察rg1是否可以改善氧化应激引起的糖皮质激素抵抗。建立balb/c小鼠uvb照射性皮炎模型,将小鼠随机分成blank、tnf-α、dex+tnf-α、uvb+dex+tnf-α、rg1+uvb+dex+tnf-α及uvb+tnf-α组,通过人参皂苷Rg1改善氧化应激引起的糖皮质激素抵抗的实验研究检测小鼠UVB照射部位表皮厚度、氧自由基、脂质过氧化反应、IL-6及IL-8的水平,观察Rg1在体内是否可以在氧化应激状态下增强DEX抗炎作用。结果:1.人参皂苷单体Rb1、Rh1、Rg1及Rb3均能显著抑制氧自由基的形成,并辅助DEX抑制炎症因子IL-6及IL-8的分泌,其中Rg1作用最为明显。2.通常状态下,DEX能够显著抑制TNF-α诱导的IL-6及IL-8的分泌,但是在UVB或者H2O2处理后,DEX上述能力下降;同时我们进一步探讨其炎症通路发现,氧化应激状态下,DEX抑制MAPKs通路中P38、ERK及JNK磷酸化的能力减弱,同时对NF-КB通路IκBα的磷酸化及P65的核转位的抑制作用也显著下降,但Rg1能够显著增DEX上述作用。3.氧化应激状态下,Rg1能够改善GCs抵抗,其作用可能通过Rg1增强Nrf2核转位,抑制ROS,上调HDAC2的表达,抑制GR的乙酰化,提高GR表达,进而增强DEX的抗炎作用。4.Balb/c小鼠UVB照射性皮炎模型证实,Rg1能够有效抑制氧化应激反应,增强DEX的抗炎作用。结论:Rg1通过激活Nrf2,抑制ROS,维持HDAC2蛋白酶体的表达及活性,下调GR的乙酰化水平,上调GR,从而改善氧化应激引起的GCs抵抗,使得GCs顺利发挥其正常抗炎功能。