大豆抗氧化肽的制备、分离纯化及结构鉴定

大豆肽是近几年来的研究热点，人们发现其除了具有易消化、易吸收、低抗原、降胆固醇、抗疲劳、增强体力等作用外，还具有较强的抗氧化作用。 本论文较系统地研究了商业酶酶解大豆分离蛋白制备生物活性肽及固态发酵豆粕制曲法制备生物活性肽的工艺条件，以及目标肽的分离纯化及其鉴定应用研究。重点研究了商业酶酶解条件、米曲霉制曲条件、大曲水解条件以及目标肽的分离纯化。 本研究以大豆分离蛋白为原料，用ORAC(oxyen radical absorbance capacity)法对三种商业蛋白酶（Alcalase、Neutrase、Pepsin）的酶解产物进行抗氧化活性评价，以制备具有抗氧化能力的大豆肽(CP)。结果表明：在其适宜酶解条件下，Alcalase酶解产物的ORAC值最高，Neutrase次之，而Pepsin酶解产物的最低。Alcalase酶解产物ORAC最高值可达Trolox当量1910.48μmol Trolox equivalent/g Peptide，谷胱甘肽当量1611.91mg Glutathione equivalent/g Peptide，说明该条件下制备的大豆肽具有强抗氧化活性。同时，还发现利用ORAC法测定大豆肽的抗氧化活性结果与DPPH法测定的结果具有显著的相关性。 以豆粕和麸皮为米曲霉制曲的氮源和碳源，研究原料碳氮比、制曲培养时间、曲精接种量对成曲水解特性及其水解产物(FP)抗氧化活性的影响，并探讨添加大豆分离蛋白和挤压大豆分离蛋白、pH条件、底物蛋白浓度和水解时间对成曲水解特性及其水解产物抗氧化活性的影响。用ORAC法对米曲霉制曲水解产物进行抗氧化活性评估，优化制曲条件及成曲水解条件以制备具有抗氧化能力的大豆肽，并与商业酶酶解制备的大豆肽进行抗氧化活性对比。结果表明：(1)制曲条件为：麸皮/豆粕为1/5、培养时间为44h、曲精接种量为0.05%(w/w)，成曲的碱性蛋白酶活力可高达3109.85U/g；(2)水解条件为：pH为7、底物蛋白浓度为8%、水解4h时，曲水解产物的ORAC值可高达2130.22μmol Trolox equivalent/g Peptide，DPPH的IC50值为0.2975mg/mL，与商业蛋白酶（ORAC为1910.48μmol Trolox equivalent/g Peptide，DPPH的IC50值为7.08mg/mL）相比，具有更高的抗氧化活性。 利用超滤、阳离子交换色谱以及凝胶过滤色谱等系列分离技术对CP/FP进行分离的过程中发现，酶解产物中的碱性组分对抗氧化活性的贡献比酸性组分大；分子量在＜1kDa范围内的组分对抗氧化活性的贡献比其他的组分大。经逐级纯化后，利用RP-HPLC在线连接的电喷雾离子质谱(ESI-MS-MS)，同时结合手动分析，最终鉴定出CP中功能肽因子的氨基酸序列结构为Ser-Phe-Val，分子量352.4Da；鉴定出FP中功能肽因子的氨基酸序列结构为Leu(Ile)-Tyr-His-Thr，分子量531.9Da。 初步探索将抗氧化肽应用在烟草滤嘴中，大豆抗氧化肽与玻璃珠的最佳吸附条件为：蛋白浓度4.0mg/mL，吸附温度30oC，吸附时间8h。大豆抗氧化肽被玻璃珠吸附后所得到的洗脱液的ORAC值以及对DPPH·自由基的清除率均有较好的保持率（分别为78.24%和76.44%），仍保持较强的抗氧化活性，达到在卷烟滤嘴中应用的前提条件，为其在卷烟滤嘴中的应用提供一定的理论依据。