川芎嗪抗大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的机制研究

研究目的 中药抗脑缺血再灌注损伤是一个重要的课题。随着社会的发展，脑血管病已经成为威胁人类生存和健康的主要疾病之一。缺血再灌注是脑血管病发展过程中的一个重要的病理过程，能导致进一步组织损伤和功能障碍，抑制再灌注损伤已经成为目前治疗缺血性脑血管病的关键环节。目前治疗脑缺血病的药物往往作用机制单一，毒副作用较大，而中药多可以从多个层次和多个环节上起到治疗作用，因此研究和阐明中药治疗脑缺血病的机制具有重大的理论和临床价值。 脑血管病与中医血瘀证紧密相关，中医治疗多采用活血化瘀法，配伍理气药以行气活血。川芎为临床常用活血化瘀药，具有活血行气之效，是临床常用于治疗缺血性脑血管病的中药之一。阐明川芎抗脑缺血再灌注的机理对于研究中药治疗缺血性脑病具有重大意义。 根据现代医学和传统中医关于脑缺血病的理论，我们将进行以下研究：(1)证明川芎的有效成分——盐酸川芎嗪可以透过血脑屏障，为其可以直接对脑产生作用提供证据。(2)对盐酸川芎嗪在抗脑缺血再灌注过程中所发挥的作用进行多层次系统研究，探讨其作用机制。希望通过此研究为临床使用川芎或川芎嗪治疗脑缺血病提供理论依据，同时也为今后研究和筛选治疗脑缺血病的中药提供一个实验方法学平台。 研究方法 我们选用SD大鼠为研究对象，制备了阻断大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血(MCAO)再灌注模型，研究盐酸川芎嗪对抗脑缺血再灌注的机制。(1)高效液相(HPLC)检测盐酸川芎嗪能否通过大鼠血脑屏障到达脑组织；(2)称量假手术组、缺血再灌注组和各用药组大鼠脑组织重量，检测脑组织含水量；(3)苏木精伊红(HE)染色，观察各组大鼠脑细胞形态的改变；(4)免疫组化染色观察GFAP表达的改变，进而反映星形胶质细胞的变化情况；(5)生化法检测各组大鼠血清NOS、iNOS含量的变化；(6)生化法检测各组大鼠血清和脑匀浆SOD含量的变化；(7)流式细胞术(FCM)检测各组大鼠脑细胞增殖周期、细胞凋亡的改变；(8)Real-Time PCR技术检测各组大鼠脑组织中缺氧诱导因子-1α表达的改变。 结果 (1)鉴于大鼠脑脊液很少，难以达到高效液相测定所需的量，我们选择测定大鼠组织中盐酸川芎嗪的含量。结果各组大鼠脑组织中均检测到盐酸川芎嗪，提示其可以穿透血脑屏障，到达脑从而对中枢产生作用，为研究盐酸川芎嗪乃至川芎对脑的作用机理提供了前提条件。(2)缺血再灌注组脑组织含水量明显高于假手术组(P＜0.01)，而三个用药组与缺血再灌注组比较，脑组织含水量明显减少(P＜0.05)，其中盐酸川芎嗪高剂量组和尼莫地平组变化最为明显，显示盐酸川芎嗪能明显减少梗塞侧脑组织的肿胀程度，减少患侧脑组织含水量。(3)缺血再灌注组大鼠梗死侧脑组织明显肿胀，外观黯淡。镜下观察可见锥体细胞排列紊乱，细胞间隙增宽，神经元变性明显，部分退变的神经元呈现凋亡特征：细胞皱缩成圆形或卵圆形，胞浆皱缩，嗜酸性增加，亦可见均质红染坏死物质和细胞核固缩、溶解等坏死特征。用药组细胞变性程度较缺血再灌注组明显减轻，其中尤以川芎嗪高剂量组和尼莫地平组最为明显，仅有少数锥体细胞胞浆深染，细胞核固缩。(4)缺血再灌注组GFAP免疫染色呈强阳性，胞体肥大，染色加深，突起增粗、变长，而假手术组仅可见极少量阳性细胞表达，用药组GFAP免疫染色则呈阳性——弱阳性改变，说明AST反应性增生减弱，提示盐酸川芎嗪可抑制脑缺血再灌注时AST的过度表达。(5)缺血再灌注组大鼠血清中NOS和iNOS均比假手术组有显著提高，用药组大鼠血清中NOS和iNOS有所下降，其中以川芎嗪高剂量组和尼莫地平组下降最为显著(P＜0.05)，提示川芎嗪可降低脑缺血再灌注时NOS尤其是iNOS的含量，减少NO的合成，减轻神经毒性反应以及由NO所诱导的神经细胞凋亡。(6)缺血再灌注组的血清和脑组织中SOD活力明显降低(P＜0.01)，三个用药组的血清和脑组织中SOD活力均有提高，其中尼莫地平组血清中SOD活力和川芎嗪高剂量组脑组织中SOD活力提高最为明显(P＜0.05)。说明盐酸川芎嗪可提高脑组织SOD活性，有利于清除自由基，减少脂质过氧化损伤。(7)缺血再灌注后细胞周期发生了明显变化，处于Go／G1期的细胞百分率明显减少，进入S期和G2／M期的细胞明显增加，与假手术组比较有显著差异(P＜0.05)，说明了缺血性脑损伤后细胞异常活跃，细胞可以重新进入细胞周期。在细胞凋亡发生率方面，缺血再灌注组大鼠脑细胞为(21.61±4.4)％，较假手术组显著增加(P＜0.05)，盐酸川芎嗪高剂量组和尼莫地平组细胞凋亡发生率较缺血再灌注组显著降低(P＜0.05)，其中以盐酸川芎嗪高剂量组变化最大。(8)经Real-Time PCR测定，发现HIF-1α在缺血再灌注组中的表达远高于假手术组，在川芎嗪低剂量组中的表达略有降低，而在川芎嗪高剂量组和尼莫地平组中的表达有明显降低，其中尼莫地平组基本接近假手术组。 结论与意义 盐酸川芎嗪抗缺血再灌注的机制已经成为近年研究热点之一，取得了有目共睹的成果，但仍存在一些问题：(1)研究多集中于盐酸川芎嗪治疗缺血性心脏病的作用机制，而对于其抗脑缺血再灌注损伤的作用机制研究较少，这和盐酸川芎嗪在脑血管病治疗中的广泛应用不相符合。(2)大多数研究均着眼于盐酸川芎嗪对功能指标的调控，并没有证据证明其可以透过血脑屏障直接作用于中枢。尽管一些学者提出盐酸川芎嗪可以透过正常的血脑屏障，但是对其在脑缺血再灌注、血脑屏障受损的情况下能否透过血脑屏障，以及透过的水平与正常情况有无区别，并没有报道。(3)研究方法比较单一。多数学者仅从某一个角度研究其抗脑缺血再灌注的机制，而脑缺血再灌注的病理生理变化是多方面、多层次的，因此只研究盐酸川芎嗪对其中一个病理环节的影响显然是不全面的。此外由于不同研究人员采用的缺血再灌注模型不尽相同，造成各种实验结果缺乏横向对比的可行性。这些问题造成现有对盐酸川芎嗪抗脑缺血再灌注的机制研究缺乏系统性，整体性。 本实验研究的创新性体现在：(1)证明了盐酸川芎嗪能够穿透血脑屏障，进入脑组织发挥直接作用，而在缺血再灌注后给药脑组织中盐酸川芎嗪含量增多，说明在此状态下药物可以更多的到达脑组织，为研究其进入脑组织对中枢产生作用提供了先决条件。(2)本研究从整体水平、细胞水平、分子水平和基因水平，针对多种病理变化，较完整系统的阐述了盐酸川芎嗪抗脑缺血再灌注损伤的机制。(3)实验采用了多种检测方法，其中Real-Time PCR具有技术水平上的先进性，与传统PCR技术相比，不仅实现了从定性到定量的飞跃，而且具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。(4)实验证明了盐酸川芎嗪在多层次多方面对脑缺血再灌注损伤起到了保护作用，作用机制与降低脑水肿、调整AST对损伤的反应、抗自由基损伤、降低NO毒性、防止血管痉挛、抗细胞凋亡、减少神经细胞变性坏死以及基因调控等多方面关系密切，具有重要的临床和理论价值。(5)本实验为研究中药通过血脑屏障、抗脑缺血再灌注损伤建立了一整套实验方法学平台，对促进中药现代化具有重要意义。