永生化细胞系具有许多原代细胞所没有的优点,如培养的均一性、稳定性和操作简便性等。原代培养细胞的分离培养费时费力,花费高,且传代次数有限,细胞生理功能容易变异,造成不同试验结果间因细胞培养代数而难以比较,使许多研究工作受到限制。许多研究证明端粒酶逆转录酶(TERT)是端粒酶活性的限速成分,外源性人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的导入能够使多种正常细胞的端粒酶活性激活,使细胞的寿命延长,甚至永生化。hTERT转染的细胞具有正常细胞的生物学特性,而不具有逃避细胞生长周期、核型不稳定、丧失血清依赖性等肿瘤转化特征。
猪血管内皮细胞是一种理想的细胞模型,普遍用于心血管系统及一些出血性疾病的研究。但作为终末分化的体细胞,缺乏端粒酶活性。在体外培养时随着传代次数的增加,细胞逐渐失去增殖能力,大约在体外培养10代左右,细胞就进入衰老期,失去其正常的生物学功能,最后出现群体细胞生长停滞,不能继续传代培养。为了给研究猪瘟病毒(CSFV)对猪血管内皮细胞致病变作用机理和其他研究提供充足的细胞材料,我们开展了猪血管内皮细胞永生化的研究。分离培养了猪脐静脉血管内皮细胞,将hTERT基因导入处于生长停滞期的猪血管内皮细胞中,进行永生化研究,获得了以下结果:
1.无菌采取猪带,分离脐静脉,用1 g/L胶原酶消化分离内皮细胞,于37℃,5%的CO2条件下培养。培养的细胞为单层贴壁生长,呈铺路石状。第Ⅷ因子相关抗原(F-ⅧRAg)和CD34因子免疫荧光鉴定为阳性。结合细胞形态学观察,结果表明,分离培养的细胞为血管内皮细胞。培养的细胞纯度高,6 d左右长成单层。在体外培养传至9～10代后,细胞生长停滞,发生衰老和死亡。
2.采用脂质体转染法,将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入原代培养的猪脐静脉血管内皮细胞。加G418筛选约1个月后,得到抗G418阳性克隆,获得2个细胞克隆。滤纸片法消化,转移,继续扩大培养。RT-PCR技术检测到hTERT mRNA在转染细胞中的表达,说明外源性hTERT稳定转染入血管内皮细胞。利用TRAP-ELISA法对转染后第10代、第20代、第30代细胞进行端粒酶活性检测,均表现为阳性,原代培养的细胞为端粒酶活性阴性。表明外源性hTERT基因可以激活猪血管内皮细胞的端粒酶活性。克隆c2来源的细胞在体外长期连续培养下,生长良好,至今传代达56代,历时约12个月。将其命名为hTERT介导的永生化猪脐静脉血管内皮细胞系(hTERT-SUVECs)。
3.体外连续培养过程中,hTERT-SUVECs呈现长梭形形态,单层细胞呈鹅卵石铺路石状排列,细胞间存在接触抑制,细胞无异形性和核浆比例倒置等肿瘤细胞特征。通过对内皮细胞重要的标志物F-ⅧRAg和CD34分子检测,表明转染后的血管内皮细胞表面标志没有丢失。绘制细胞生长曲线图和培养观察,转染细胞仍具有正常的细胞增殖周期和接触抑制性;细胞周期检测表明hTERT-SUVECs生长增殖较原代细胞活跃,其细胞凋亡率远低于传至第6代的原代细胞,具有克隆形成能力。以上结果初步表明,转染细胞基本上保持了正常血管内皮细胞的生物学特性。
4.对第35代hTERT-SUVECs和第3代SUVECs细胞核型检测表明,染色体形态结构与正常SUVECs比较没有变化,均共有38条染色体。hTERT-SUVECs细胞具有正常核型。hTERT-SUVECs接种6周龄裸鼠后经2个月,无肿瘤形成。hTERT-SUVECs和SUVECs软琼脂内培养2周后,均不能生长。通过MTT比色法检测了hTERT-SUVECs在不同血清浓度下的增殖能力,结果表明,同原代细胞一样,转染细胞在高血清浓度的培养条件下增殖较快,血清依赖性无显著降低。总之,hTERT-SUVECs基本上为正常细胞,无转化特征,保持了原代猪血管内皮细胞的生物学特征。
5.分别采用放射免疫法和硝酸还原酶法测定了hTERT-SUVECs和SUVECs细胞在不同培养时间里的ET、PGI2、NO分泌量。结果表明,3种血管活性物质在两者中代谢水平变化一致;在相同的培养时间内,两者在ET和PGI2的分泌量上接近,无显著差异。而在NO的分泌量上差异显著,在hTERT-SUVECs细胞培养上清中NO含量低于SUVECs。总体上说,hTERT-SUVECs没有丧失其分泌功能,hTERT的导入不影响其正常的生理功能。
综上所述,本研究成功的将人端粒酶逆转录酶基因导入猪脐静脉血管内皮细胞中,激活了其端粒酶活性,延长了细胞在体外培养的寿命,永生化的猪脐静脉血管内皮细胞仍能保持其正常的生物学特性和分泌功能,这在国内外均属首次报道。
