血虚证指血液不足或血液的濡养功能减退的一种病理状态,其病因、临床特点与现代医学的贫血有密切的关系。血虚证模型可以通过60Coγ射线照射、腹腔注射环磷酰胺和综合放血等方法制作,前期从外周血各血液成份改变、骨髓造血干/祖细胞的动态变化、CD34+细胞的改变等方面考察了血虚证发生发展的特点。四物汤是中医治疗血虚证的首选方剂由熟地黄、当归、白芍和川芎组成,是中医临床上治疗血虚证的经典名方。四物汤补血的主要物质基础为果糖、芍药苷、阿魏酸、川芎嗪,目前对四物汤的研究主要集中在整体、细胞水平。为了深入探讨血虚证本质以及四物汤补血作用的分子机制,本文用代谢组学和分子生物学技术考察了血虚证发生发展的特点和四物汤有效单体成份的补血作用机制。
前期采用基因芯片和蛋白质组学相关技术对血虚证模型的发生机理作了系统研究,结果表明:血虚证的发生发展与造血、能量代谢相关基因和蛋白质的改变密切相关,为进一步探讨其作用机制,本论文应用基于NMR的代谢组学方法对60Coγ射线照射、腹腔注射环磷酰胺、综合放血所致血虚证模型进行了深入探讨。结果表明三种诱因所致动物血清、骨髓、胸腺和脾脏的代谢成份较正常动物有明显变化,其中乳酸、胆碱、牛磺酸、脯氨酸、长链脂肪酸、羟丁酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、糖类物质及不饱和脂肪酸等化合物谱峰变化明显。三种模型的血清及其他组织都在造模后表现为乳酸含量下降,因此认为三种模型可能都通过抑制能量代谢造成损伤。另外在三种模型的血清中,以及照射和环磷酰胺模型中的胸腺和脾脏成份中都发现胆碱含量减少,提示在这三种模型所致损伤及其修复过程中有神经递质分泌的改变。由于三种模型的代谢成份改变不尽相同,因此推测,三种模型还可能存在其他各自损伤机制。
前期对四物汤补血机制和有效成份进行了深入研究,发现四物汤能通过影响细胞周期、减少造血细胞凋亡等途径促进造血。同时阐明了果糖、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪为四物汤主要有效单体成份。为进一步研究芍药苷的补血机制,探讨其促进EPO表达的靶受体和下游信号通路。我们利用低氧环境刺激促红细胞生成素(EPO)表达的细胞模型,对芍药苷补血作用机制进行了研究。以不同剂量(0.02、0.2、2、20μmol·L-1)芍药苷、腺苷A1受体拮抗剂(DPCPX 10μmol·L-1)、A1受体激动剂(CPA 1μmol·L-1)、腺苷A2a受体拮抗剂(SCH58261 0.2μmol·L-1)和PI-3K通路抑制剂(LY294002 30μmol·L-1)处理HepG2细胞,分别在常氧和浓度为3%的低氧条件下培养,用RT-PCR检测EPO、腺苷A1、A2a和A2b受体基因的表达情况;用Western blotting方法检测EPO、AKT和磷酸化AKT蛋白表达情况。实验结果表明在常氧培养36h后芍药苷抑制HepG2细胞中EPO基因和蛋白的表达,在低氧培养16和24小时后2μmol·L-1浓度的芍药苷能促进EPO基因表达。腺苷A1受体拮抗剂(DPCPX)、腺苷A2a受体拮抗剂(SCH58261)以及PI-3K通路抑制剂(LY294002)能抑制芍药苷升高EPO基因表达的现象。另外也证明芍药苷在低氧环境中能通过PI-3K促进AKT磷酸化。经低氧环境作用8、16、24小时后芍药苷、DPCPX、SCH58261和LY294002对腺苷A1、A2a和A2b受体基因表达没有影响;同时考察了低氧环境对腺苷A2a受体基因影响,发现经低氧环境作用16和24小时后该受体表达增强。因此我们推测芍药苷可能通过同时激活细胞膜上腺苷A1和A2a受体,然后进一步激活下游的PI-3K通路,使AKT磷酸化蛋白表达增加来促进低氧条件下EPO基因的表达。
