UVA对人皮肤角质形成细胞TNF-α、IL-1β、IL-10表达的影响及抗氧化剂、JNK抑制剂的干预研究

前言 臭氧层破坏的加剧和太阳风暴的频繁出现导致到达地面的紫外线（ultraviolet，UV）日益增加，过多接触UV可引起皮肤红斑、光老化、免疫抑制乃至肿瘤等多种生物学效应。长波紫外线（UVA）在太阳光谱中所占比例大，且穿透力强，其对机体免疫抑制的研究倍受关注。 表皮中皮肤角质形成细胞（keratinocytes，KC）含量最为丰富，占表皮细胞的90％以上，KC可通过释放细胞因子间接地影响机体免疫功能。目前尚不清楚UVA是如何诱导KC细胞因子的产生。 本研究通过体外培养的人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞株），探讨UVA照射对人KC细胞TNF-α、IL-1β、IL-10表达的影响，并分别以抗氧化剂（β-胡萝卜素）、JNK抑制剂（SP600125）干预处理，揭示氧化应激和JNK传导通路在UVA诱导人KC细胞TNF-α、IL-1β、IL-10表达中的作用。 实验方法 一、细胞培养 HaCaT细胞以MEM培养基（内含1‰非必需氨基酸、10％胎牛血清、100U／ml青霉素、100mg／ml链霉素）于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养，待细胞呈单层、亚融合状态时，以0.25％胰蛋白酶消化，制成单个细胞悬液后传代培养。 二、细胞活力 将细胞接种于96孔培养板中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养，待细胞生长至约60％融合，弃培养液，PBS冲洗3次，按100μl／孔加入PBS，以0～3.6 J／cm2不同剂量的UVA照射细胞，MTT法检测各组细胞活力。 待细胞培养至约60％融合，向细胞培养液中加入终浓度为3μM的β-胡萝卜素（DMSO溶解），对照组和照射组加入等量DMSO。1h后弃培养液，PBS冲洗3次，按100μl／孔加入PBS，以0～3.6 J／cm2不同剂量的UVA照射干预组和照射组细胞，再按上述方法检测各组细胞活力。 三、磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平 将细胞接种于预先置有盖玻片的6孔培养板中，培养2d，弃培养液，PBS冲洗3次，按1.0ml／孔加入PBS，以2.4 J／cm2UVA照射细胞，分别于照射后0、2、4、12、24、48h采样。对照组细胞不照射，其他处理同照射组。免疫荧光法检测细胞磷酸化JNK和非磷酸化JNK水平。 按上述方法培养细胞。向干预组细胞的培养液中加入终浓度为3μM的β-胡萝卜素（DMSO溶解），对照组和照射组加入等量DMSO。1h后弃培养液，PBS冲洗3次，以1.0ml／孔加入PBS，照射组和干预组细胞以2.4 J／cm2UVA照射，再按上述方法采样并检测各组细胞磷酸化JNK和非磷酸化JNK水平。 四、TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA水平及蛋白表达 将细胞接种于9.0cm平皿中培养，待细胞呈亚融合状态，弃培养液，PBS冲洗3次，按5.0ml／皿加入PBS，根据细胞活力检测结果，选择2.4 J／cm2作为UVA辐射剂量，分别于照射后0、2、4、12、24、48h收集细胞及上清液。对照组不照射，其他处理同照射组。RT-PCR方法检测细胞TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA水平；ELISA方法检测上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10含量。 待细胞呈亚融合状态，向干预组细胞的培养液中加入终浓度为3μM的β-胡萝卜素或10μM的SP600125（DMSO溶解），对照组和照射组加入等量DMSO。1h后弃培养液，PBS冲洗3次，按5ml／皿加入PBS，照射组和干预组细胞经2.4／cm2UVA照射，再按上述方法采样并检测各组细胞TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA及蛋白水平。 五、统计分析 采用SPSS12.0统计软件对实验数据进行分析，检验水准α为0.05。 实验结果 一、细胞活力 3.0、3.6 J／cm2UVA照射使细胞活力明显降低（P＜0.05）；2.4 J／cm2及其以下剂量的UVA照射对细胞活力无明显影响；β-胡萝卜素预处理细胞后，各组细胞活力差异无统计学意义（P＞0.05）。 二、磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平 2.4 J／cm2UVA照射HaCaT细胞后0～24h，磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平均逐渐升高，24h达高峰，48h有所降低，但仍高于0～12h各检测时点；对照组磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平则随着采样时点延长而逐渐升高，48h达高峰。统计结果表明，照射组细胞磷酸化JNK水平在各采样时点及非磷酸化JNK水平于0～2h及12～48h均明显高于对照组（P＜0.05）。 β-胡萝卜素干预组细胞磷酸化JNK水平于照射后0h基本同照射组，二者均明显高于对照组（P＜0.05）；2h后干预组细胞磷酸化JNK水平明显低于照射组（P＜0.05），24h后明显低于对照组（P＜0.05）；β-胡萝卜素干预组细胞非磷酸化JNK水平于0～48h均明显低于照射组（P＜0.05），4～48h明显低于对照组（P＜0.05）。 三、TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA水平及蛋白表达 （一） TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA水平 0～48h对照组细胞TNF-α、IL-1βmRNA水平较平稳；照射组细胞TNF-α、IL-1βmRNA水平于照射后0h开始升高，2h达高峰，12h后恢复至对照组水平。统计结果表明，0～4h照射组细胞TNF-α、IL-1βmRNA水平明显高于对照组（P＜0.05）。 β-胡萝卜素干预组细胞TNF-α、IL-1βmRNA水平于照射后0～48h基本同对照组，0～4h干预组及对照组细胞TNF-α、IL-1βmRNA水平均明显低于照射组（P＜0.05），12～48h各组细胞TNF-α、IL-1βmRNA水平差异无统计学意义（P＞0.05）。SP600125干预组细胞TNF-αmRNA水平于照射后0～48h均低于照射组，其中，0～4h及24～48h两组差异有统计学意义（P＜0.05），并于12～48h干预组细胞TNF-αmRNA水平明显低于对照组（P＜0.05）；SP600125干预组细胞IL-1βmRNA水平于照射后0～48h均明显低于照射组（P＜0.05），并于12～48h明显低于对照组（P＜0.05）。 以2.4 J／cm2UVA照射细胞后12h，IL-10 mRNA呈弱表达，照射组其他各检测时点及对照组、β-胡萝卜素和SP600125干预组细胞均未见IL-10 mRNA表达。 （二） TNF-α、IL-1β、IL-10蛋白表达 0～48h对照组细胞TNF-α、IL-1β蛋白表达水平较平稳；照射组细胞TNF-α、IL-1β蛋白表达水平于照射后0～4h基本同对照组，12h高于对照组，24h后恢复至对照组水平。统计结果表明，照射组细胞TNF-α、IL-1β蛋白表达水平于照射后12h明显高于对照组（P＜0.05）。 β-胡萝卜素干预组细胞TNF-α、IL-1β蛋白表达水平于照射后0～48h基本同对照组，干预组及对照组细胞TNF-α、IL-1β蛋白表达水平于12h明显低于照射组（P＜0.05）。SP600125干预组细胞TNF-α蛋白表达水平于0～48h均低于照射组和对照组，其中，12～48h明显低于照射组（P＜0.05），24～48h明显低于对照组（P＜0.05）。SP600125干预组细胞IL-1β蛋白表达水平于0～4h基本同对照组和照射组，12h明显高于对照组（P＜0.05），但明显低于照射组（P＜0.05），24～48h明显高于照射组和对照组（P＜0.05）。 以2.4 J／cm2UVA照射细胞后24h，培养液中可检测到较低水平的IL-10蛋白，照射组其他各检测时点及对照组、β-胡萝卜素和SP600125干预组细胞均未检测到IL-10蛋白表达。 结论 3.0 J／cm2及其以上剂量的UVA照射使体外培养的HaCaT细胞活力明显降低，β-胡萝卜素对UVA诱导的HaCaT细胞活力下降具有拮抗作用。 2.4 J／cm2UVA照射使HaCaT细胞JNK活性增强，β-胡萝卜素对UVA致HaCaT细胞JNK活性增强具有拮抗作用。 2.4 J／cm2UVA照射使HaCaT细胞TNF-α及IL-1β基因转录增强、蛋白表达增多，正常情况下HaCaT不表达IL-10，UVA照射可诱导其表达。β-胡萝卜素、SP600125对UVA上调HaCaT细胞TNF-α、IL-1β表达以及对IL-10表达的诱导均具有拮抗作用。