布拉氏酵母菌对实验性大鼠非酒精性脂肪性肝炎的疗效及其作用机制的研究

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指除乙醇和其他明确的肝损伤因素外，以弥漫性肝大泡性脂肪变、伴或不伴炎症为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化以及肝硬化。非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)是单纯性脂肪肝发展成为肝纤维化及肝硬化的必经途径。 近年随着研究的不断深入．由小肠细菌过度生长(small intestinalbacterialovergrowth,SIBO)、细菌易位、肠黏膜通透性改变等所致的肠源性内毒素血症(intestinal endotoxemia，IETM)在NASH病程中起到了关键作用。内毒素是革兰氏阴性杆菌细胞壁外层的主要成分，也称脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，是肝损伤中的一个重要因子，主要与释放的炎性细胞因子和介质有关，它能激发机体引起强烈的炎症反应，促进单纯性脂肪肝向非酒精性脂肪性肝炎进展。宿主细胞膜上的模式识别受体是介导细胞识别LPS，并启动LPS反应的首要环节。LPS与白细胞分化抗原14（Cluster of differentiation14,CDl4）和Toll样受体4（Toll-like receptor4,TLR4）相互作用产生跨膜信号引起LPS介导的细胞激活，从而通过LPS-CD14-TLR4信号通路诱导炎症细胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-6、NO等的大量表达，进而损伤肝脏。 布拉氏酵母菌是一类益生菌，可以维持肠道微生物的平衡，抑制肠源性内毒素的产生，促进体内内毒素向肠腔转移，加速内毒素的排泄，减少内毒素对肝脏的刺激，使CD14、TLR4表达减低,最终减少促炎性细胞因子的分泌和释放,起到保护肝脏的作用。因此，我们拟通过研究布拉氏酵母菌干预下非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织CD14、TLR4表达的变化,进一步探讨益生菌在治疗非酒精性脂肪性肝病中的机制,从而以利于临床合理开展非酒精性脂肪性肝病治疗和防治工作。 目的：高脂饮食构建非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型，测定血清内毒素的水平，以及该过程中布拉氏酵母菌对大鼠肝组织CD14、TLR4表达的影响，探讨布拉氏酵母菌对实验性大鼠非酒精性脂肪性肝炎的疗效及其可能的作用机制。 方法：42只雄性SD大鼠，体重180±20g，适应性喂养1周后随机分为如下3组：①Control组14只，给予基础饲料喂养；②Model组14只，给予高脂饲料喂养（88%普通饲料+2%胆固醇+10%猪油）；③Treatment组14只，给予高脂饲料喂养。实验动物均分笼（每笼4只）饲养于25±2℃、明暗各12h的动物实验室内，自由饮水进食。于喂饲16周末各组随机处死4只，行肝组织HE染色确定非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型成功。自17周开始治疗组给予布拉氏酵母菌散剂（78*108CFU/kg﹒d-1）灌胃，正常对照组及模型组给予等容量蒸馏水灌胃。每周记录动物体重1次，根据体重变化调节灌胃计量，连续进行至24周末给药期结束，处死全部大鼠。 观察肝脏的大体情况，并完整切除肝脏，称肝脏湿重；采用全自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶，谷草转氨酶和甘油三酯；采用鲎试剂法测定血清内毒素水平；采用HE染色观察肝脏病理变化；采用免疫组织化学方法观察肝组织CD14、TLR4蛋白的表达情况；采用荧光定量PCR(realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR)方法测定肝组织CD14mRNA、TLR4mRNA的水平。 结果：①喂饲16周末时，对部分大鼠肝组织行HE染色：高脂饮食的大鼠出现肝脏脂肪变、气球样变及炎症细胞浸润，明确证实给予高脂饮食成功复制了NASH大鼠模型。②大鼠体重、肝湿重及肝指数(肝湿重/体重×100%)：24周末时称重，模型组大鼠的体重（567.60±18.89）、肝重（19.68±2.68）、肝指数（3.47±0.43）均明显高于正常对照组的体重(460.71±14.71)、肝重（11.53±0.98）及肝指数（2.5±0.12）（P<0.05）。与模型组相比,治疗组体重（521.50±19.40）、肝重(15.06±1.32)及肝指数(2.89±0.20)均明显降低(P<0.05)。③血清生化指标：模型组ALT(103.44±8.41)较正常对照组(39.10±9.37)显著增高（P﹤0.05），与模型组相比，治疗组ALT(71.03±7.98)明显降低(P<0.05)；模型组AST(276.95±25.06)，较正常对照组(145.37±15.19)显著增高（P﹤0.05），与模型组相比，治疗组AST(191.68±14.62)明显降低(P<0.05)；模型组TG(0.93±0.14)较正常对照组(0.54±0.10)显著升高（P﹤0.05），治疗组TG(0.73±0.11)较模型组明显下降（P<0.05）；④模型组血清内毒素水平（0.3600±0.0293）显著高于正常对照组（0.12±0.05）(P <0.05)，与模型组相比,治疗组血清内毒素水平（0.2226±0.0156）明显降低(P<0.05)。⑤肝脏病理学改变：16周末大鼠肝组织HE染色显示，正常对照组大鼠肝细胞内均无脂肪变性及气球样变，部分大鼠肝组织内可见少量炎性细胞浸润；给予高脂饮食的模型组大鼠肝组织均可见大泡性和小泡性混合型脂肪空泡，弥漫性的肝细胞脂肪变性，部分气球样变肝细胞周围伴有明显炎性细胞浸润。随着造模时间的逐渐延长，模型组大鼠肝脏脂肪变程度越来越明显，24周末脂肪变程度较前明显加重，以重度为主，肝细胞胞浆内充满大量脂肪空泡，还可见到程度不等的小叶内炎症，汇管区炎症及点灶状坏死，NAS炎症评分与正常组相比有显著性差异（P﹤0.05）。与模型组相比，治疗组NAS炎症评分较模型组明显改善（P<0.05）。⑥免疫组化显示，正常对照组肝组织低表达CD14（0.0735±0.0134）、TLR4（0.0764±0.0189）；模型组肝组织CD14（0.2118±0.0399）、TLR4表达(0.2151±0.0167)较对照组显著增强(P <0.05)；治疗组CD14（0.1435±0.0604）、 TLR4（0.1538±0.0257）较模型组明显减低(P <0.05)。⑦应用荧光定量PCR技术分析，正常对照组肝组织低表达CD14mRNA（0.4529±0.2439）、TLR4mRNA（0.9049.±0.1135）；模型组肝组织CD14mRNA（1.5315±0.2527）、TLR4mRNA (2.4198±0.2289)较正常对照组显著增强(P <0.05)；治疗组CD14mRNA（0.9967±0.2981）、TLR4mRNA（1.6943±0.1872）较模型组减弱(P <0.05)。 结论： 1高脂饮食可成功建立大鼠NASH模型，NASH大鼠存在肠源性内毒素血症。 2布拉氏酵母菌可能通过减轻NASH大鼠肠源性内毒素血症，降低肝脏CD14和TLR4的表达，显著改善肝细胞脂肪变和炎症程度，起到治疗NASH的作用。