党参和甘草提取物对IEC-6细胞迁移多胺调控信号通路作用的研究

研究背景： 胃肠粘膜损伤后,可以通过修复重建上皮细胞的完整性。细胞迁移是快速修复的主要形式,指粘膜损伤后早期,受损细胞脱落,附近区域的正常细胞迁移覆盖受损区域。研究发现,细胞迁移主要由多胺介导钾通道激活信号通路调控。粘膜损伤后,细胞中多胺增加,促进电压门控钾通道蛋白表达,钾通道开放,钾离子外流,膜超级化,从而增强Ca2+内流驱动力,使Ca2+内流,细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]cyt)升高,增强RhoA的活性,激活ROK/ROCK。ROK/ROCK的激活促进肌球蛋白轻链磷酸化,刺激应力纤维的形成,从而促进损伤后细胞迁移。相反,消除多胺则抑制细胞迁移。 细胞迁移是益气健脾中药胃肠粘膜保护作用机理之一。本课题前期研究表明,党参和甘草对IEC-6细胞迁移的促进作用与影响多胺有关,为进一步证实党参、甘草促进细胞迁移与多胺介导钾通道激活信号通路的关系,对该通路相关指标进行检测。 研究目的： 观察益气健脾中药党参、甘草对肠上皮细胞迁移及多胺介导钾通道激活信号通路不同指标的影响,探讨党参、甘草胃肠粘膜损伤修复的作用机理。 研究内容和方法： 1.在划痕法小肠上皮细胞(IEC-6)迁移模型,观察受试药党参、甘草糖提取物、黄酮、皂苷部位25mg/L、50mg/L、100mg/L剂量对IEC-6细胞迁移的影响。 2.筛选出促进IEC-6细胞迁移的党参糖提取物、甘草糖提取物作受试药(苯酚-硫酸法测定以葡萄糖计,其糖含量分别为41.0%、49.3%),观察其对细胞迁移过程中多胺介导钾通道激活信号通路的作用。荧光定量PCR法检测钾通道蛋白Kv1.1mRNA表达,Western bolt法检测Kvl.1蛋白和RhoA蛋白表达；流式细胞仪检测细胞膜电位；激光共聚焦显微镜检测细胞内游离Ca2+的水平。 研究结果： 1.党参、甘草糖提取物、黄酮、皂苷对细胞迁移的影响：党参糖提取物、黄酮部位的50mg/L和100mg/L,党参皂苷100mg/L可促进细胞迁移；甘草糖提取物、黄酮部位的50mg/L和100mg/L,甘草皂苷100mg/L可促进细胞迁移。 2.党参、甘草糖提取物对细胞迁移过程钾通道的影响：①党参糖提取物50mg/L、100mg/L,甘草糖提取物100mg/L可提高细胞迁移过程钾通道蛋白Kv1.1mRNA的表达水平；②党参、甘草糖提取物50mg/L、100mg/L可提高Kvl.1蛋白的表达水平；③党参、甘草糖提取物100mg/L、200mg/L可逆转多胺合成抑制剂二氟甲基鸟氨酸(DFMO)或钾通道阻滞剂4-氨基吡啶(4-AP)对Kvl.1蛋白表达的抑制。 3.党参、甘草糖提取物对细胞迁移过程膜电位的影响：①党参糖提取物50mg/L甘草糖提取物50mg/L可促进IEC-6细胞膜超级化水平。②党参糖提取物100mg/L,甘草糖提取物100mg/L和200mg/L可逆转DFMO的去极化作用；③党参糖提取物200mg/L、甘草糖提取物200mg/L可逆转4-AP的去极化作用。 4.党参、甘草糖提取物对细胞迁移过程细胞内游离Ca2+水平的影响：①党参、甘草糖提取物50mg/L、100mg/L可提高细胞迁移过程细胞内Ca2+的水平；②党参糖提取物100mg/L、200mg/L可逆转DFMO对细胞内Ca2+的抑制。 5.党参、甘草糖提取物对细胞迁移过程RhoA蛋白表达的影响：①党参、甘草糖提取物50mg/L、100mg/L可提高RhoA蛋白表达；②党参、甘草糖提取物100mg/L、200mg/L可逆转DFMO对RhoA蛋白表达的抑制。 研究结论： 党参、甘草糖提取物促进细胞迁移的作用与多胺介导钾通道激活信号通路有关,可能是党参、甘草胃肠粘膜损伤修复的作用机制之一