单细胞水平黄芪多糖对肝窦内皮细胞微区力学影响的研究

肝纤维化(Hepatic fibrosis, HF)是各种慢性肝病进展至肝硬化必经的病理过程,现已证实肝纤维化在一定程度上可逆。肝窦内皮细胞(Sinusoidal endothelial cells, SECs)作为肝脏非实质细胞之一,是肝窦壁的组成细胞,直接接受血流等力学刺激作用,其结构与功能可维持正常的肝脏微循环。当肝窦内皮细胞力学性质或其力学微环境发生改变时,其独特的窗孔结构就会消失并在内皮下形成基底膜,即所谓的肝窦毛细血管化,这成为肝纤维化形成的病理基础,继而导致肝纤维化的发生,故肝窦内皮细胞在肝纤维化的形成过程中具有十分重要的作用。大量临床实践证实,肝纤维化的基本病机特点为气虚血瘀,黄芪作为补气中药的代表,临床及实验研究均证实其具有很好的抗肝纤维化作用,而黄芪多糖是黄芪中含量最多的有效单体成分。本实验以体外培养的肝窦内皮细胞为研究对象,观察细胞的超微结构,并初步探讨黄芪多糖干预后细胞微区力学性质的变化,为进一步研究能否通过改变肝窦内皮细胞的结构与力学性质来逆转肝纤维化奠定一定的实验基础。 本论文内容分为两部分：实验研究和文献研究。 第一部分：实验研究 一、肝窦内皮细胞的原代培养、鉴定及纳米成像 目的：本研究以肝窦内皮细胞为研究对象,通过对肝窦内皮细胞的体外培养及鉴定,借助以原子力显微镜(Atomic force microscopy, AFM)为主体的高分辨原位成像技术以及低真空环境扫描电子显微镜(Environmental scanning electron microscope, ESEM),在单细胞水平进行肝窦内皮细胞微尺度形貌结构的纳米成像。方法：采用大鼠肝脏原位胶原酶灌注、Percoll密度梯度离心结合选择性贴壁的方法分离并纯化肝窦内皮细胞,CD14染色证实细胞的纯度。将肝窦内皮细胞脱水、干燥并固定后,在低真空环境扫描电子显微镜下观察细胞的超微结构。运用纳米中心实验室已建立的原子力显微镜/快速激光共聚焦荧光显微镜(Laser scanning confocal fluorescence microscope, LSCFM)/全内反射荧光显微镜(Total internal reflection fluorescence microscope, TIRFM)联合成像系统,实现肝窦内皮细胞活体三维形貌成像。结果：原代培养出的细胞CD14染色阳性鉴定为肝窦内皮细胞。在倒置显微镜下可观察并记录肝窦内皮细胞不同时期的生长铺展状态；将细胞脱水固定后,在低真空环境扫描电子显微镜下可清晰的看到细胞窗孔大小、微丝的分布以及细胞之间的连接情况等超微结构；利用原子力显微镜可对液态培养环境中的附壁肝窦内皮细胞进行实时动态三维纳米成像。结论：运用改良后的肝脏原位胶原酶灌注、Percoll密度梯度离心结合选择性贴壁法能够获得纯度较高、活力较强的肝窦内皮细胞；运用环境扫描电镜及原子力显微镜可以对体外培养的肝窦内皮细胞进行纳米成像。 二、单细胞水平黄芪多糖对肝窦内皮细胞微区力学影响的研究 目的：本研究以体外培养的肝窦内皮细胞为研究对象,运用原子力显微镜力谱技术,探讨黄芪多糖对单细胞水平肝窦内皮细胞微区力学作用的影响，初步研究肝窦内皮细胞在受到药物干预后细胞的微区力学响应,为进一步开展中药干预肝窦内皮细胞损伤模型的肝纤维化研究奠定实验基础。方法：利用原子力显微镜采集力曲线,应用力谱技术,计算肝窦内皮细胞的杨氏模量；同时应用单一浓度的黄芪多糖干预肝窦内皮细胞,采集力曲线并计算杨氏模量,比较黄芪多糖十预组和对照组的杨氏模量,初步探讨黄芪多糖对肝窦内皮细胞微区力学影响,从而建立体外黄芪多糖/肝窦内皮细胞微区力学实验体系。结果：运用原子力显微镜采集力曲线并统计计算后得出：当探针压入深度为300纳米时,黄芪多糖组细胞的杨氏模量中位数为0.644107千帕,空白对照组为0.448870千帕；当探针压入深度为500纳米时,黄芪多糖组细胞的杨氏模量中位数为0.700691千帕,空白对照组为0.540682千帕；无论探针压入深度为300纳米还是500纳米,黄芪多糖干预组所测得的肝窦内皮细胞杨氏模量中位数均明显高于空白对照组,差异具有统计学意义(P值<0.01)。结论：原子力显微镜可以通过对肝窦内皮细胞局部施力并描绘力曲线来研究细胞的弹性等微区力学性质；肝窦内皮细胞在50微克/毫升浓度的黄芪多糖作用下,细胞杨氏模量显著增加,即黄芪多糖在此浓度下能够使肝窦内皮细胞的刚性增加而变“硬”,提示：黄芪多糖可能是通过使细胞变“硬”以减少血流作用于肝窦壁的能量耗散,从而提高了血流剪应力,使血流动力学发生改变,进而能够改善肝脏微循环。 第二部分文献研究： 本部分从目前肝窦内皮细胞与肝纤维化形成的研究概况、肝纤维化的中医研究进展以及黄芪防治肝纤维化的研究现状三方面分别进行综述。