合欢皮化学成分及其构效关系和抗肿瘤活性机制研究

合欢皮为豆科植物合欢（Albizia julibrissin Durazz．）的干燥茎皮，2000年版《中华人民共和国药典》一部收载合欢皮具有解郁安神，活血消肿的功能。用于心神不安，忧郁失眠，肺痈疮肿，跌扑伤痛等症，文献报道及前期工作表明合欢皮有抗癌活性。文献报道对合欢属植物的化学研究较多，但对合欢皮的抗肿瘤等活性尚没有深入的研究，本论文对其化学和抗癌活性进行了较深入的研究，具体内容如以下： 1．文献工作 系统查阅了国内外合欢属植物化学和药理研究文献，完成了综述，对合欢皂苷的波谱特征进行了总结和分析。 2．合欢生物活性研究 用体内及体外方法对合欢的抗炎、镇静和抗癌活性进行了研究，确定了抗炎、镇静和抗癌活性部位。 3．化学研究 从合欢皮用硅胶、大孔树脂、Sephadex LH-20及HPLC等多种色谱方法分离了；30个化合物，利用TOF-MS和NMR等波谱方法，特别是2D-NMR方法（1H-1H COSY、HSQC、HMBC、TOCSY等）共鉴定了29个化合物的结构，其中13个为新化合物。 从抗肿瘤活性部位分离得到19个三萜皂苷，鉴定了18个皂苷的结构，9个为八糖皂苷（1-9），8个为九糖皂苷（10-17），1个为十糖皂苷（18）。18个皂苷中13个皂苷为新化合物（**），2个为新天然产物（*）。皂苷元为金合欢酸，皂苷均为苷元3位、21位及28位连接糖的三糖链皂苷，结构中还有1～2个单萜烯酸基，分子量在2000左右。 从镇静活性部位分离并鉴定了5个木脂素（19-23），3个为双环氧木脂素，1个为单环氧木脂素，1个为环木脂素，该结果与日本学者报道木脂素是合欢镇静活性成分一致。 为了研究抗癌构效关系，将抗癌活性部位物质酸水解，从水解物中分离并鉴定了4个三萜化合物（24-27），另外还获得2个其它类型的化合物（28-29），结构见Figure 1。 4．抑制癌细胞活性筛选及构效关系研究 将从合欢抗癌活性部位用Sephadex LH-20分离得到的几个部分及从中分离得到的化合物用MTT法和SRT法，以HL-60、PC-3MIE8、MCF-7、Bel-7402、BGC-823和Hela等六种癌细胞进行了抑制癌细胞活性测试，实验结果表明皂苷元，木质素，单 沈阳药科大学博十学位论文摘要 菇昔均没有抑制癌细胞的作用，皂昔有抑制癌细胞的活性，所以皂营是合欢抗癌作用的 物质基础，对多种癌细胞抑制活性多次筛选结果表明，皂昔对肝癌细胞的抑制作用最强， 重现性好。对人乳腺癌和宫颈癌细胞也有良好的抑制活性。分析不同结构的合欢皂营类 化合物抑制癌细胞活性测试结果，表明有如下主要构效关系: （1）昔元28位连接2个单菇酸的皂昔抑制癌细胞作用比连接1个单菇作用强。 （2）普元3位有乙酞氨基糖的皂昔抑制癌细胞作用强。 （3）营元28位连接的外侧单菇烯酸中，6位碳构型为6仁S时抑制癌细胞活性比6’一R 强。 5.抑制癌细胞作用机制研究 在研究合欢皂营对人源癌细胞抑制作用时发现Bel一7402、MC卜7和Hela癌细胞对 合欢皂普敏感，并结合细胞库现有癌细胞的状况，首先将合欢皂营对Hela和MC卜7两 种癌细胞的抑制作用机制进行了研究。实验结果表明合欢皂营Ajts等诱导日eLa细胞死亡 具有明显的剂量和时间依赖关系:形态学观察可见明显的凋亡小体，琼脂凝胶电泳显示 典型的ONA Ladder，这提示Ajts等诱导Hela细胞发生经典凋亡。合欢皂营Ajts作用Hela 细胞24h，日CI一2和Bd一xL蛋白表达明显下调，而Bax表达水平升高。Ajts下调!CAO表达 水平，这种下调被CaSPase一3抑制剂（z一OEVO一fmk）阻止在Ajts作用Hela细胞12h时。 因此推测Ajts诱导的Hela细胞凋亡是Caspase家族和Bcl一2家族共同调控进行的。 细胞形态学实验结果表明合欢皂昔Ajts诱导MC卜7癌细胞死亡具有明显的剂量 和时间依赖关系，但作用于MCF一7细胞72h后，琼脂凝胶电泳也没有出现典型的梯状 带，说明Ajts诱导MCF一7细胞死亡，却没有启动经典的凋亡途径。Aj坛作用MC卜7细 胞48h时明显将细胞阻滞在GZIM期，但是作用至72h时，阻滞细胞在各个时期。Western blot实验表明，经过Ajts作用72h时的MC卜7细胞，BCI一2和BCI一xL蛋白表达水平明 显下调，而Bax表达水平升高，同时PARP蛋白与!CAO蛋白的表达减少，这一实验结 果提示Ajts诱导MC卜7细胞死亡可能是通过调节Bax与Bcl一2和BCI一xL蛋白的表达比 率，激活caspase的级联实现的。 合欢皂普在Hela细胞，MCF一7细胞中诱导细胞死亡机制表明在两种细胞中合欢皂 营发挥抗癌活性机制各不相同，这可以进一步解释合欢抗癌作用的靶向性及选择性。