丙戊酸肝毒性高危因素作用机理及其防治的实验研究

目的：研究丙戊酸（VPA）在不同年龄、以及在与酶诱导剂联合 用药时肝脏毒副作用差异及其机理，并探讨左旋肉碱（LC）和抗氧化 剂防治 VPA 肝毒副作用的疗效与机制。 方法：健康婴儿（生后 21 日龄）及成年 Wistar 大鼠共 112 只行对 比研究，以不同剂量 VPA 连续灌胃 30 天，分别设立正常对照组（T0）、 小剂量 VPA 组（200mg/kg/d, T1）、小剂量 VPA＋PB 组（T2）、大剂量 VPA 组（500mg/kg/d, T3）、大剂量 VPA＋PB 组（T4）、大剂量 VPA＋ LC 组（T5）、大剂量 VPA＋PB＋LC 组（T6）、大剂量 VPA＋VitE＋辅 酶 Q10（CoQ10）组（T7）以及大剂量 VPA＋PB＋VitE＋CoQ10组（T8） 等共 9 组。差速离心制备肝线粒体。（1）化学比色法测定肝功酶谱、 血脂、血液凝血因子、血氨、L-肉碱、线粒体呼吸酶系及脂质过氧化 反应等；（2）高效液相色谱、流式细胞仪、原位杂交方法分别检测 VPA 与PB血药浓度、肝线粒体跨膜电位以及肝细胞色素P450还原酶mRNA 的表达；（3）采用 Oil-Red-O 染色、HE 及电镜等技术，观察肝细胞及 其线粒体形态结构的改变。 结果：(1) 各实验组均获得与临床一致的VPA治疗血浓度，多在 52～87.7μg/ml之间，最高未超过160μg/ml。联合PB用药时，VPA浓度 平均下降30.88%～47.02%，表明PB加速了VPA在体内的代谢；(2) 无 3 重庆医科大学博士学位论文 论婴儿或成年鼠，即使大剂量VPA／VPA+PB，对肝功酶谱ALT、AST 及CHO、TG、HDL、LDL等血脂均无明显影响，而凝血因子PT、TT、 APTT、Fbg，以及血氨和L-肉碱含量均有显著改变。补充L-肉碱改善 肝脏凝血因子合成功能、血氨指标，而VitE+CoQ10仅表现出对肝脏凝 血因子合成功能的保护； (3) 大剂量VPA／VPA＋PB使婴儿鼠肝线粒 体细胞色素aa3含量分别下降58.80%和61.80%，成年组分别下降37.55% 和46.53%，与对照组比较，差异均非常显著 (P<0.01)。VitE+CoQ10对 细胞色素aa3含量有明显保护作用。检测肝线粒体呼吸链关键酶琥珀酸 脱氢酶（SDH）和细胞色素氧化酶（CCO）活性表明，仅有大剂量VPA ／VPA＋PB婴儿鼠SDH活性与对照组存在非常显著性差异（P<0.01）， 分别降低44.8%和57.9%。婴儿和成年鼠CCO活性均显著降低，且婴儿 鼠降低更明显，与对照皆有非常显著差异（P<0.01）。L-肉碱及VitE + CoQ10对SDH和CCO活性均有明显保护作用； (4) 无论婴儿还是成年 组，大剂量VPA／VPA＋PB动物的肝线粒体GSH含量均显著低于同龄 对照组（P<0.01），而线粒体MDA含量均显著增高（P<0.05），婴儿鼠 更严重。VitE+CoQ10使GSH和MDA含量维持于正常水平，提示有效阻 止了线粒体脂质过氧化进程。L-肉碱对异常GSH和MDA含量无明显改 善；(5) 成年各组实验鼠之间肝线粒体膜电位MMP无显著异常。但婴 儿鼠中大剂量VPA＋PB组下降21.47%，与对照差异显著（P<0.05）。L- 肉碱及VitE+CoQ10均有效维护MMP正常； (6) 大剂量VPA引起婴儿鼠 肝内P450还原酶mRNA平均光密度值（OD）增加（P<0.05），但对成年 4 重庆医科大学博士学位论文 鼠无影响。合并使用PB时，则引起各年龄鼠该酶mRNA表达均增强； (7) 肝切片Oil-Red-O和HE染色显示，婴儿大剂量VPA／VPA+PB组均 出现门管区为主的肝细胞脂肪变性，脂肪细胞数分别高出成年鼠7.5和 12倍，差异非常显著（P<0.01）。L-肉碱或VitE+ CoQ10干预后脂肪变性 肝细胞数均有非常显著减少（P<0.01），表明两者皆能有效阻止肝细胞 脂肪变性，但VitE+CoQ10的作用不及L-肉碱；（8）虽然肝细胞线粒体功 能在大剂量VPA影响下有明显异常，但电镜下未见明显结构改变。 结论：（1）成功制备了婴儿和成年大鼠长时间口服 VPA 的动物模 型，其稳态血浓度与临床治疗血浓度一致；（2）证实婴儿期、大剂量 或与 PB 等肝酶诱导剂联合用药，是 VPA 诱发肝损伤的重要因素；（3） 在 VPA 诱发的肝损伤中，肝细胞线粒体虽无电镜下形态学的明显改变， 但其功能明显异常，集中表现为线粒体膜电位和膜通透性异常，呼吸 酶系和脂肪酸β-氧化功能障碍，导致体内脂质过氧化增加，血氨浓度 增高，蛋白合成功能异常和肝细胞脂肪性变；（4）在 VPA 肝损伤过程 中，血氨增高或凝血因子等肝合成功能，较肝酶谱和血脂检测更多见 异常；（5）L-肉碱与抗氧化剂对 VPA 肝损伤均有较好防治作用，但前 者在提高体内肉碱含量，降低高血氨症和稳定线粒体膜电位效果明显， 而 VitE 和 CoQ10则能明显增强肝细胞抗脂质氧化能力。两类药物联合 使用，会有更好疗效。