TRPV5/TRPV6对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化及成骨细胞信号传递的影响

钙通道是一种与钙离子转运有关的存在于细胞膜上的特定蛋白质,通过钙通道蛋白构象变化形成开放或关闭状态控制钙离子流动,发挥钙离子对成骨细胞生物功能的调节作用。在瞬时性受体电位通道（TRP）超家族中,TRPV5和TRPV6是目前唯一已知的钙离子高选择性通道。TRPV5和TRPV6受1,25（OH）2D3、PTH、饮食钙、雌激素和药物影响的调节在以往的研究中已经明确,最近研究热点集中在钙调节蛋白（CaM）、S100A10-膜联蛋白-2复合物、80K-H等辅助蛋白的作用方面。而TRPV5和TRPV6在成骨细胞中的作用还有待于进一步探讨。 此外,在成骨细胞的分化、成熟以及在骨形成过程中,有多种信号通路参与调控。其中MAPK信号转导系统是细胞外信号引起细胞核内反应的重要通道之一,而RANK则主要介导调节破骨细胞的信号转导。 本研究旨在通过检测大鼠BMSCs来源不同阶段的成骨细胞TRPV5和TRPV6表达情况,观察TRPV5和TRPV6与成骨细胞中钙离子、MAPK和RANKL的量变关系,研究TRPV5和TRPV6对成骨细胞生长、分化的影响,并将它们与成骨细胞MAPK、RANK信号系统联系起来,为深入研究成骨细胞生物功能和骨代谢提供线索和依据。 本研究用密度梯度离心法从大鼠骨髓成功分离、传代培养BMSCs,并将BMSCs诱导为成骨细胞,对BMSCs和成骨细胞鉴定结果符合各自的细胞特性。采用免疫组化法和RT-PCR技术检测BMSCs向成骨细胞诱导分化过程中及成骨细胞中TRPV5和TRPV6的表达情况,发现在大鼠BMSCs向成骨细胞分化过程中及成骨细胞中TRPV5和TRPV6通道均有不同程度阳性表达,且随着诱导分化时间的延长,TRPV5和TRPV6表达逐渐增强。应用1,25（OH）2D3、CuCl2改变TRPV5和TRPV6通道状态后用激光共聚焦显微镜观察细胞内钙离子荧光强度,并用RT-PCR技术半定量检测1,25（OH）2D3、CuCl2应用前后TRPV5、TRPV6、MAPK和RANKL mRNA表达量的变化。发现1,25（OH）2D3使TRPV5和TRPV6 mRNA表达增高、细胞内钙离子荧光强度增加并使MAPK和RANKL的mRNA表达增高;而TRPV5和TRPV6通道阻断剂CuCl2对TRPV5和TRPV6 mRNA表达无影响,但使细胞内钙离子荧光强度降低并使MAPK和RANKL mRNA表达下降。研究结果提示:TRPV5和TRPV6通道可能是调节成骨细胞增殖的候选通道;TRPV5和TRPV6钙离子通道通过调节成骨细胞内钙离子含量的变化进而调节成骨细胞MAPK和RANK信号传导通路,最终调节成骨细胞增殖能力和骨代谢功能。?