新型二甲基苯并吡喃衍生物诱导Hela细胞死亡的机制研究

二甲基苯并吡喃衍生物是一类来源于天然产物和化学合成,具有广泛生理活性的化合物。其生理活性主要包括抗菌、抗氧化、抗肿瘤、开放钾离子通道等,因此以二甲基苯并吡喃为化学基序,合成具有独特的生理活性和结构特征的苯并吡喃衍生物一直是合成化学家感兴趣的课题之一。本文的研究目的是考察一系列新型二甲基苯并吡喃衍生物对人宫颈癌HeLa细胞的体外抗癌活性,并对其分子机制进行深入研究。 本研究首先合成了一系列6位取代基不同的二甲基苯并吡喃衍生物(1-7),并利用WST-8法测定它们的体外抗肿瘤活性。实验结果表明6位取代基对HeLa细胞毒性至关重要。由于化合物6,1-[(3S,4R)-4-(2-ethoxy-4-methyl-1H-pyrrol-1-yl)-3-hydroxy-2,2-dimethylchroman-6-yl-3-phenylurea (C6)的细胞毒性最高(IC50138μM),而且在作用36h后能显著抑制HeLa细胞的增殖,因此我们对C6诱导HeLa细胞死亡的分子机制作进一步研究。通过形态学观察、DNA含量分析和Annexin V-FITC/PI双染实验充分证明了C6作用48h后诱导HeLa细胞凋亡。Western免疫印迹法表明,C6作用HeLa细胞后,促凋亡蛋白Bax (Bcl-2associated X)上调,抑凋亡蛋白Bcl-2(B-cell lymphoma-leukemia2)下调,使得Bax/Bcl-2的表达比例显著升高；胞浆中的cytochromec明显增多,而caspase-9和caspase-3的前体表达均明显下降,表明C6是通过线粒体/cytochrome c和caspase依赖途径诱导HeLa细胞凋亡的。在细胞周期分布分析及[3H]胸腺嘧啶掺入实验中,C6作用24h即可阻滞HeLa细胞于Gl期,抑制DNA复制。同时,碱性单细胞凝胶电泳表明C6引发DNA损伤。 由于C6的抗癌活性(IC50138μM)并不理想,我们又合成出一系列4位取代基不同的二甲基苯并吡喃衍生物(8-14),WST-8法对其细胞毒性的初步测定发现4位取代基对HeLa细胞毒性也非常重要。其中三氟甲基苯哌嗪取代的二甲基苯并吡喃(3R,4S)-2,2-dimethyl-6-nitro-4-(4-(3-(trifluoromethyl)phenyl)piperazin-1-yl)chroman-3-ol(C13)对HeLa细胞的半数抑制浓度(IC50)降低到17μM,较为理想,因此对C13诱导HeLa细胞死亡的分子机制作进一步的深入研究。形态学方法、Hoechst33342核荧光染色、Annexin V-FITC/PI双染法均证实C13诱导HeLa细胞死亡的方式是凋亡。C13可以上调Bax表达,下调Bcl-2表达,使Bax/Bcl-2比例显著增加；降低线粒体膜电势,诱导cytochrome c释放到胞浆,并激活caspase-9和-3,表明C13诱导细胞凋亡时激活以线粒体为中心的信号转导途径。同时,caspase-8前体蛋白表达量在C13作用的HeLa细胞中也显著降低,证明C13可以同时激活死亡受体途径。多种机制可以引发凋亡,包括DNA损伤。碱性单细胞凝胶电泳表明C13作用12h后即可以导致HeLa细胞DNA损伤,同时p53的表达也显著增加。作用24h后,p53又上调了其目标基因p21的表达,DNA含量分析也表明HeLa细胞于24h被阻滞于G1期,抑制G1/S期转换,阻碍DNA复制。ROS (reactive oxygen species)是造成DNA损伤的重要原因之一,并且与p53紧密相关,但实验结果表明ROS并没有参与C13诱导的HeLa细胞凋亡。在研究过程中发现C13可以抑制多药耐药相关蛋白P-gp (P-glycoprotein)的底物rhodamine123流出胞外,但其作用机制尚不清楚,C13对P-gp的作用以及对肿瘤细胞多药耐药性的影响还有待于进一步考察。