Akt/mTOR/p70S6K通路在HSC-T6的活化增殖中的作用及栀子苷抗肝纤维化作用研究

肝纤维化(fibrosis of liver)实质是一种由多种原因病毒、代谢、药物、酒精、血吸虫等引起的慢性肝损伤的伤口愈合反应，它的主要表现是肝内细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)在狄氏间隙(Space of Disse)的肝窦内皮细胞层大量过度沉积及所导致的肝脏功能的损伤，是慢性肝病发展到肝硬化必经阶段。大量实验研究已经证实，活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是过度沉积的ECM的主要来源，而且HSC的活化是肝纤维化发生发展过程中的核心环节，通过抑制HSC活化增殖可以减缓肝纤维化的发生发展。 栀子是药食两用的传统中药，又称为黄栀子、山栀子，药用栀子是茜草科植物栀子的成熟果实，具有利胆、镇痛、抗炎等作用。栀子苷(geniposide)，属于环烯醚萜类化合物，是栀子药效作用的主要有效成分，有研究表明，栀子苷具有利胆、保肝、抗炎等方面作用。本实验室前期研究结果表明，栀子苷具有肝脏保护作用，进一步研究发现，栀子苷能够抑制PDGF介导的HSC-T6细胞增殖活化，其具体作用机制可能与阻断了Akt/mTOR/p70S6K通路有关。 核糖体70S小亚基S6蛋白激酶(p70S6K)是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mamm--alian target of Rapamycin，mTOR)的下游底物，它是一种核糖体蛋白激酶，可以促进细胞的生长和增殖，研究表明，在癌症等疾病中，p70S6K活化水平明显升高，抑制其表达可明显抑制肿瘤细胞的增殖。鉴于p70S6K在细胞增殖中的重要作用，我们设想阻断p70S6K的活性可以抑制HSC的活化增殖。为验证这一设想，采用Western blot方法检测了磷酸化p70S6K在肝纤维化大鼠肝组织以及活化的HSC-T6中的表达水平，结果发现，在纤维化组织和活化的HSC-T6中，磷酸化p70S6K的表达水平都明显升高，提示，p70S6K有可能参与调节HSC的活化增殖，影响肝纤维化的发生发展。为进一步阐明p70S6K与HSC活化增殖之间的联系，本课题进行了以下研究。 1.磷酸化p70S6K在肝纤维化大鼠肝组织和活化的肝星状细胞系HSC-T6中的蛋白表达 SD大鼠灌胃给予CCl4，建立肝纤维化模型，Western blot检测磷酸化p70S6K、肝纤维化大鼠肝组织中的蛋白表达；PDGF(10ng/ml)诱导HSC-T6细胞活化，Western blot检测磷酸化p70S6K在活化的HSC-T6细胞中的蛋白表达。实验结果发现，磷酸化p70S6K在纤维化的肝组织和活化的HSC-T6细胞中表达均升高了。 2.抑制p70S6K的活性对大鼠肝星状细胞系HSC-T6活化增殖的影响 利用雷帕霉素(2，20，50ng/ml)预处理HSC-T6细胞2h后，再加PDGF(10ng/ml)作用24h或48h，运用MTT和流式细胞仪检测HSC-T6细胞增殖情况和细胞周期分布，Western blot和RT-PCR检测HSC-T6细胞磷酸化p70S6K、α-SMA和Collagen I的表达情况；利用LipofectamineTM2000将特异性p70S6K-siRNA转染到HSC-T6内，下调p70S6K的表达，降低其活性，运用MTT和流式细胞仪检测HSC-T6细胞增殖情况和细胞周期分布，Western blot和RT-PCR检测HSC-T6细胞磷酸化p70S6K、α-SMA和Collagen I的表达情况。实验结果发现，雷帕霉素和p70S6K-siRNA作用均降低了p70S6K的活性，抑制了HSC-T6的活化和增殖。 3.栀子苷单体对PDGF诱导的HSC-T6活化增殖的影响 不同浓度的栀子苷(20，50，100，200，400μg/ml)作用于HSC-T6细胞，MTT检测细胞活力，判断栀子苷的细胞毒性；用低、中、高浓度的栀子苷(20，50，100μg/ml)预处理HSC-T6细胞2h后，再加PDGF(10ng/ml)作用24h或48h，运用MTT检测细胞活力， Western blot检测HSC-T6细胞活化增殖MAPK通路蛋白ERK、p38活化水平以及Akt/mTOR/p70S6K通路蛋白活化水平的表达。实验结果发现，栀子苷抑制了HSC-T6的活化增殖，同时降低了Akt/mTOR/p70S6K通路蛋白活化水平，对ERK、p38活化水平无显著影响。