鹿茸多肽对大鼠软骨细胞退变老化的影响

目的：在细胞和分子水平观察体外培养的大鼠关节软骨细胞退变老化以及鹿茸多肽对这一变化的影响，并对软骨细胞复制性老化的机制以及鹿茸多肽的抗老化作用机制进行初步探讨。方法：1．采用酶消化法获取大鼠关节软骨细胞，应用台盼蓝排斥试验检测获取的软骨细胞活性。2．对软骨细胞退变老化进行观察，采用相差显微镜观察其生长情况，透射电镜观察细胞结构，阿力新蓝染色检测胞外基质硫酸GAG含量和结构，免疫细胞化学法和RT-PCR方法检测Ⅱ型胶原鉴定软骨细胞，以MTT比色法描绘生长曲线、检测生长状态，组化法检测老化相关β-半乳糖苷酶，流式细胞仪分析细胞周期和增殖指数。3．将P3软骨细胞分为空白对照组、鹿茸多肽不同浓度组、硫酸氨基葡萄糖不同浓度组进行传代培养，同时以P2代软骨细胞为对照组，进行组化检测老化相关β-半乳糖苷酶，阿力新蓝染色检测胞外基质硫酸GAG含量和结构，MTT比色检测增殖，免疫细胞化检测PCNA和Ⅱ型胶原，RT-PCR检测Ⅱ型胶原、Aggrecan蛋白，流式细胞仪分析细胞周期和增殖指数等方法，对鹿茸多肽抗软骨细胞退变老化进行分子生物学研究。4．将连续三代P2、P3、P4代软骨细胞及鹿茸多肽干预后的P4代软骨细胞进行老化机制研究。采用免疫细胞化检测p16、pRb、E2F、CyclinD、CDK4等因子表达水平，TRAP—ELISA检测端粒酶活性，进而考察软骨细胞老化过程中各因子的变化，同时考察鹿茸多肽对这一过程的作用。结果：1．酶消化法软骨细胞的分离培养可以获得大量活性优良的软骨细胞，经鉴定可以表达硫酸GAG、Ⅱ型胶原。2．从P4代开始，软骨细胞老化相关β-半乳糖苷酶表达大幅度提高，细胞停滞于G1期，增殖能力减弱，出现去分化，证明软骨细胞开始退变老化。3．鹿茸多肽可以抑制老化相关β-半乳糖苷酶的表达、促进鼠软骨细胞增殖、减少G1期细胞含量、促进软骨细胞表型等，可以抑制软骨细胞退变老化，其抗软骨细胞退变老化作用优于硫酸胺基葡萄糖。4．在软骨细胞退变老化过程中，调控细胞周期和生长的因子表达出现如下变化：p16↑—pRb↑—E2F↓—CyclinD↑—CDK4。5．鹿茸多肽可以逆向调控老化相关调控因子的表达。结论：1．酶消化法软骨细胞的分离培养可以提供良好的软骨细胞。2．体外培养软骨细胞P4代开始老化。3．鹿茸多肽具有显著的抗软骨细胞退变老化作用，其作用强于硫酸胺基葡萄糖。4．在软骨细胞退变老化过程中，老化相关调控因子出现如下变化：p16↑—pRb↑—E2F↓—CyclinD↑—CDK4↓—端粒酶↓。5．鹿茸多肽鹿茸多肽可能通过下调软骨细胞p16、pRb、CyclinD的表达、上调软骨细胞E2F、CDK4、端粒酶的表达来实现其抗软骨细胞退变老化的作用。