乳酸菌胞外多糖的生物合成及其组成和体外抑瘤活性研究

1、从藏灵菇粒申筛选到一株高产胞外多糖（EPS）的乳酸菌菌株FML02-8，在脱脂乳培养基中多糖产量为187.6mg/L。通过FML02-8的菌体培养特征及部分生理生化特征研究，初步鉴定FML02-8为乳酸菌的链球菌属（Streptococcus）。菌株的生长特性表明其产酸能力强、凝乳快、生长迅速，在MRS培养基中最适生长温度为37℃，生长的最适初始pH值为7.0。 2、证明菌株FML02-8产EPS的特性不受质粒调控，具有一定的遗传稳定性。 3．筛选了适于FML02-8合成EPS的最适培养基为：葡萄糖（或其它碳源）2.0％ 蛋白胨2％ 酵母浸出汁0.5％、乙酸钠0.5％ 柠檬酸三铵0.2％ 吐温80 0.1％MgSO4 0.01％ MnSO4 0.005％ K2HPO4 0.2％。用单因素试验证明了该菌株可以利用不同的碳源合成不同量的EPS，其中以葡萄糖的合成量最高，碳源的最适添加量均为20g/L。 4、用SAS8.0的四因素二水平析因设计筛选了影响EPS合成的显著因素为温度、初始pH和时间，用中心组合设计得出了优化的EPS产量模型为：EPS=-3764.49+79.42*温度+729.90*PH+16，30*时间-0.97*温度*温度-52.67*PH*PH -0.49*时间*时间。并对该模型进行了验证。在优化条件下，以葡萄糖为碳源，FML02-8合成EPS产量达400mg/L。 5、3L发酵罐的pH控制发酵表明：发酵过程的pH控制也影响FML02-8合成EPS的产量，通过流加碱控制pH5.5，EPS的合成量达503.7mg/L，较未控制时的产量提高了约30％。 6、通过Sevage法、三氯乙酸法脱蛋白的效果比较，发现终浓度3.5％的三氯乙酸法脱蛋白效果好，蛋白质脱除率可达到83.4％。确定乙醇沉淀法提取EPS的条件为：乙醇终浓度75％，沉淀时间12小时，提取温度4℃，溶液pH值6.0到6.5。 7、研究了Scpharose 4B凝胶过滤色谱分级分离EPS的条件，确定的最佳分离条件为：样品浓度750mg/L，上样体积5mL，洗脱剂（0.1MNaCl）流速30mL/hr。在这一最适条件下，FML02-8分别以葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳清粉为碳源合成的胞外多糖EPSG、EPSF、EPSL、EPSS、EPSM、EPSW均能被纯化为两个级分，EPSG纯化的两级分比例为26.3：1，多糖回收率可达90.5％，纯度鉴定结果为纯多糖。 8、用红外光谱法对FML02-8分别以葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳清粉为碳源合成的胞外多糖EPSG、EPSF、EPSL、EPSS、EPSM、EPSW的结构进行了初步分析， 乳酸菌胞外多糖的生物合成及其组成和体外抑瘤活性研究 6个多糖样品的红外光谱图均呈现多糖的特征吸收峰，均为a一构型的毗喃糖，但波形、 特征吸收波段、波峰强度有差别。用H PLC法测定BPS。、EPsF、EPSL、EPss、EPSM、EPs、 的峰值分子量（Mp）分别为:41092、54029、45468、46996、46257、4s46sDa一t。ns。 用气相色谱法分析6个多糖样品的单糖组成及摩尔比分别为:EPS。一半乳糖:鼠李糖 一1.60:1; EPS。一葡萄糖:甘露糖一1.98:1; EPSL一半乳糖:鼠李糖=4.的:1; EPSs 一半乳糖形成的半乳聚糖;EPSM一葡萄糖:鼠李糖:甘露糖=1.41:1.60:1; EPS* 一半乳糖:葡萄糖:鼠李糖二2.26:1.33:1。结果表明，碳源对FML02一8合成EPS 的影响不仅在产量，而且影响EPS的结构，包括分子量、单糖组成及摩尔比等。 9、通过对FML02一8以不同碳源发酵得到的纯化后的EPS进行体外抑瘤功能测定， 表明EPS。、EPSF、EPSL、EPSs、EPS。、EPS，与腹水型肉瘤细胞5180共培养48hr后，均 可抑制肿瘤细胞的增殖。在10一4 00“g/mL的浓度梯度内，EPS。作用效果存在剂量依 赖效应。EPS、、EPSL、EPSs、EPSM、EPS。浓度在10一1 00林g/mL时，抑瘤作用与多糖存 在剂量效应关系，提高浓度后这种剂量效应则不存在，且在1 00林g/mL的浓度下均出 现T抑制率高峰。EPS。、 EPS、、EPSL、EPSs、EPS。、EPSF在1 00“g/mL的浓度下与·5180 共48hr后，抑制率分别达37.7%、28.8%、34.2%、33.6%、34.9%、36.3%。 10、研究EPS。、EPS、、EpSL、Epss、EPS，、EPSF6个多糖样品体外对脾淋巴细胞的转 化作用，结果表明一定浓度的多糖对静止淋巴细胞和ConA激活的淋巴细胞均有促转 化作用，且6个多糖样品对淋巴细胞的促转化效果与其对5180的抑制作用相一致。 EPS对免疫细胞无抑制作用，在体外有提高细胞免疫的功能。6个多糖样品的体外免 疫活性仍在10一1 00拼g/mL的浓度内呈剂量效应。FML02一8胞外多糖与静止和ConA激 活的脾淋巴细胞共培养上清对肿瘤细胞5 1 80的抑制作用增强，说明多糖可促进淋巴 细胞分泌细胞因子，发挥抑癌作用。且多糖与ConA激活状态下的淋巴细胞共培养时 这种细胞因子的量有所上升。