反应停调控肺癌细胞株诱导血管形成机制研究

恶性实体肿瘤的生长和转移依赖于血管生成，肿瘤血管是肿瘤细胞生长和转移的形态学基础，肿瘤血管除向肿瘤细胞提供营养外，还不断地向人体其它部位输送肿瘤细胞，目前普遍认为，肿瘤的生长存在两个明显不同的阶段，即无血管的缓慢生长阶段和有血管的快速生长阶段。前者主要依靠弥散供氧，氧的最大弥散距离为150μm，当肿瘤直径超过2-3mm3时，其继续生长就需要血液供应, 因此，抗肿瘤新生血管的形成，是肿瘤临床治疗中的一个值得研究的新方向。以新生血管形成的各个环节及其发生过程中的生化改变为靶点，研制血管生成抑制剂，控制肿瘤生长和转移，正在成为肿瘤防治的重要途径。肿瘤转移离不开新生血管,血管生成抑制剂的应用不仅使肿瘤得不到营养，达到饿死肿瘤的目的，而且切断了肿瘤转移的途径，可有效抑制肿瘤转移。 肺癌是肿瘤中最常见的一种恶性肿瘤，对人类健康和生命威胁最大，肺癌与其它实体瘤存在共性，且其特点是结构复杂，血管更丰富，易发生转移。研究还表明，肺癌的发生、发展和转移与肿瘤血管生成密切相关，所以，肺癌及其转移癌的血管生成研究是肿瘤血管生成研究的理想模型，研究肺癌血管生成将为治疗开辟一条新途径。迄今，肺癌的治疗仍不能令人满意，为提高肺癌的治愈率和患者的生活质量，探索新的治疗方案是十分必要的。研究证明反应停具有抗肿瘤作用，其抗肿瘤作用主要与抑制肿瘤血管形成有关，但是，目前国内外对反应停抗肿瘤血管形成机制的研究尚未形成系统的理论，对其确切机制尚未阐明。本课题从抗血管形成方面探讨反应停抑制肺癌生长和转移的机制。 目的： 探讨反应停抗肺癌血管形成的作用机制，为肺癌的治疗提供新的研究途径。 方法： 1. 用RPMI1640培养人脐静脉血管内皮细胞株ECV304和人肺癌细胞株SPC-A-1，不同浓度反应停在有或无兔肝微粒体作用的情况下进行给药，通过MTT法评估细胞的抑制率。 2. 收集用反应停预处理的SPC-A-1细胞的上清液，用明胶酶谱分析法检测明胶酶的活性。 3. 提取各实验组作用24小时后的SPC-A-1细胞总蛋白，通过蛋白质印迹法检测bFGF和MMP-2的水平。 4. 采用鸡胚尿囊膜进行反应停对血管形成影响的评估。 5. 建立Lewis肺癌模型，给予不同剂量的反应停，设置阴性对照和为阳性对照，称取肿瘤块的重量，用免疫组化的方法检测bFGF、MMP-2和MVD，通过蛋白质印迹法检测bFGF和MMP-2的水平。 结果： 1. 浓度为0.8、8和80μg/ml组的反应停无论是否经兔肝微粒体作用，SPC-A-1细胞增殖的OD值与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。 2. 浓度为0.8、8和80μg/ml组的反应停未经兔肝微粒体作用，对ECV304增殖的OD值以及鸡胚尿囊膜的血管形成与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。 3. 浓度为8和80μg/ml组的反应停经兔肝微粒体作用，对ECV304增殖的OD值以及鸡胚尿囊膜的血管形成与对照组比较有显著性差异(P<0.05)，而且各浓度组之间也存在显著性差异(P<0.05)，与对应浓度的单纯反应停组比较存在显著性差异(P<0.01)。 4. 浓度为8和80μg/ml组的反应停未经兔肝微粒体作用对SPC-A-1分泌的MMP-2和MMP-9的活性分别与对照组比较，比值均接近1：1；经兔肝微粒体作用后，明胶酶的活性分别与对照组比较，MMP-2的活性比值分别为1：2.1和1：3；MMP-9活性比值分别为和1：1.8；1：2.5。 5. 浓度为8μg/ml组的反应停经兔肝微粒体作用后对SPC-A-1表达的bFGF和MMP-2水平与对照组相比存在显著性差异(P<0.01和P<0.05)。 6. 反应停剂量为200和400mg/kg时能抑制Lewis肺癌的生长，抑瘤率分别为40.66%和51.15%，两组之间无显著性差异（P>0.05），两组与阴性对照组相比有显著性差异(P<0.01)，与阳性对照组相比无显著性差异（P>0.05）；反应停下调Lewis肺癌中bFGF和MMP-2的表达及减少肿瘤微血管密度(P<0.05)。 结论： 1. 反应停无论是否经兔肝微粒体作用对SPC-A-1的增殖无明显抑制作用。 2. 反应停经兔肝微粒体代谢后，能抑制ECV304细胞的增殖、下调SPC-A-1细胞分泌的明胶酶活性和表达的bFGF和MMP-2水平，能抑制鸡胚尿囊膜血管形成。 3. 反应停具有抑制Lewis肺癌生长的作用，抑制Lewis肺癌bFGF和MMP-2的表达和抑制血管内皮细胞的增殖可能是反应停调控Lewis肺癌血管形成的机制之一。