玉竹治疗糖尿病肾病物质基础研究

目的:百合科黄精属植物玉竹Polygonatum odoratum (Mill.) Druce的干燥根茎为临床治疗糖尿病的常用药之一。本课题组前期研究结果表明,玉竹乙醇提取物三氯甲烷分离部位对链脲佐菌素诱导的糖尿病模型大鼠肾脏具有保护作用,其机制与抑制蛋白质非酶糖基化终末产物的形成有关。本文研究玉竹抑制蛋白质非酶糖基化作用有效成分、制备有效成分对照品、建立药材有效成分含量测定方法和提取工艺、研究有效成分提取物对糖尿病肾病的作用。 方法:采用牛血清白蛋白-葡萄糖反应体系模型筛选为指导,运用十八烷基键合硅胶柱色谱和制备液相色谱手段进行有效部位化学成分分离,利用质谱、一维和二维核磁共振波谱技术鉴定化合物结构;采用大孔吸附树脂结合制备液相色谱技术制备有效成分对照品;采用高效液相色谱技术建立药材有效成分含量测定方法;采用正交试验法建立药材有效成分提取工艺;采用链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型研究有效成分提取物对其肾脏的保护作用。 结果:从玉竹抑制蛋白质非酶糖基化有效部位中分离得到三种二氢高异黄酮类化合物,结构分别为3-(4′-羟基苯甲基)-5,7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮(I),3-(4′-羟基苯甲基)-5,7-二羟基-6,8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮(II)和3-(4′-甲氧基苯甲基)-5,7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮(III)。三种二氢高异黄酮类化合物对蛋白质非酶糖基化反应均有明显的抑制作用,IC50分别为56.30μM、46.05μM和107.10μM,强于阳性对照盐酸氨基胍(IC50 = 123.48μM)。建立大孔吸附树脂结合制备液相色谱技术制备三种二氢高异黄酮类化合物对照品的方法,峰面积归一化法和不加校正因子主成分自身对照法测定其纯度均大于98 %。建立HPLC-DAD法测定玉竹药材中三种二氢高异黄酮类化合物的含量,优化色谱条件为色谱柱:Diamonsil ODS(250 mm×4.6 mm,5μm);柱温:30℃;流动相:甲醇-0.1 %冰醋酸溶液;线性梯度洗脱:0min(A 60 %,B 40 %)→5min(A 60 %,B 40 %)→25min(A 80 %,B 20 %)→35min(A 80 %,B 20 %);流速:1.0 mL·min-1;检测波长:297 nm,优化提取方法为80 %甲醇回流提取120 min,方法学考察结果表明化合物I进样量在0.1068～2.1360μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系;化合物II进样量在0.0564～1.1280μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系;化合物III进样量在0.0108～0.2160μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系,化合物I低、中和高不同浓度平均加样回收率分别为99.37 %、98.67 %和100.03 %,RSD分别为2.11 %、1.85 %和1.81 %;化合物II低、中和高不同浓度平均加样回收率分别为99.46 %、99.60 %和100.10 %,RSD分别为1.73 %、1.93 %和2.07 %;化合物III低、中和高不同浓度平均加样回收率分别为99.63 %、100.52 %和99.29 %,RSD分别为1.97 %、1.78 %和2.28 %。建立玉竹药材二氢高异黄酮的提取工艺,最佳提取工艺为12倍量80 %乙醇回流提取2次,每次1 h。玉竹二氢高异黄酮提取物对链脲佐菌素诱导的糖尿病模型大鼠肾脏具有保护作用,降低血清肌酐、尿素氮和尿蛋白排泄率,降低肾皮质中蛋白质非酶糖基化终末产物含量,降低肾组织中转化生长因子-β1的表达,肾小球肥大、基底膜增厚、系膜区增宽和系膜基质增生等病变均有不同程度改善。 结论:采用现代科学技术诠释中医消渴症常用药物玉竹的物质基础和作用机制,首次发现二氢高异黄酮类化合物基于抑制蛋白质非酶糖基化终末产物形成机制对糖尿病肾病的治疗作用,制备玉竹有效成分对照品,建立玉竹药材有效成分含量测定方法和提取工艺,填补了该研究领域的空白,为利用玉竹开发具有自主知识产权的创新药物奠定基础。