家蚕热休克蛋白Bmhsp21.4基因的研究

热休克蛋白(heat shock proteins,HSP),一种应激诱导而产生的分子伴侣,有一个80-100氨基酸残基组成α-晶体蛋白结构域,分子量大约在12-43 kD。据分子量大小和功能一般分为三个家族:HSP70、HSP90和小分子热休克蛋白家族。小分子热休克蛋白(small heat shock proteins,sHSP)是一种非常多样性的家族,不同种属的生物体有不同的种类,分子量在15-30 kD。 筛选本实验室家蚕蛹期cDNA文库,发现一条已知的家蚕小热休克蛋白的基因Bmhsp21.4。其包含一个564 bp的开放阅读框,编码一个由187个氨基酸残基组成的蛋白,预测分子量为21.4 kD,等电点为5.958。我们将其插入到pET-28a(+)载体,成功构建重组质粒pET-28a(+)-Bmhsp21.4 ,并转化感受态细胞BL21(DE3) ,经IPTG诱导Bmhsp21.4表达,超声破碎细胞后用SDS-PAGE分析,发现在30 kD左右的位置有一条特异性蛋白条带。SDS-PAGE结果显示该蛋白部分以可溶形式存在,经层析纯化后和质谱分析,得到该重组蛋白的分子量为24.862 kD,证实了该蛋白表达的正确性。用纯化的蛋白免疫雄性新西兰大白兔,获得多克隆抗血清,效价达1:6400以上。应用Western blotting及RT-PCR分析家蚕五龄幼虫的脂肪、精巢、卵巢、皮、气管、马氏管、丝腺、中肠和头部等组织及卵、幼虫、蛹和蛾四个时期中BmHSP21.4的分布,我们在很多组织中检测到了明显的信号,而在头部、皮及精巢的信号很弱。热激试验中,以温度为梯度,研究五龄幼虫中丝腺、马氏管及头部三个组织中BmHSP21.4蛋白在正常和受激后的表达变化情况,当热激温度达到40℃-45℃时BmHSP21.4表达量最大。以热激时间为梯度,同样对五龄幼虫丝腺、马氏管及头部三个组织进行热激,研究其在不同温度下BmHSP21.4蛋白量的变化情况,发现热激时间为2.5 h-3 h时BmHSP21.4表达量明显高于其它热激时间。最后利用家蚕卵巢细胞BmN研究BmHSP21.4在细胞中的间接免疫荧光实验,BmHSP21.4主要存在于在细胞核中,还有一部分存在胞质。