复方丹参滴丸是由丹参、三七、冰片三味中药组成的复方药,该复方药主要适应症为冠心病、心绞痛,此外,对高血压、高脂血症、脑血栓、糖尿病等多种疾病也有很好的疗效。药理学研究表明,复方丹参滴丸中酚酸类成分具有提高机体抗凝和纤溶活性、抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗氧化及保护心脏微血管内皮细胞、改善微循环障碍等作用;皂苷类成分具有改善血管内皮细胞功能、抑制血管平滑肌细胞增殖、抗血栓形成、扩张血管及保护心肌等作用。为了解复方丹参滴丸对心血管疾病防治的作用机制,本实验从研究复方丹参滴丸对小鼠体内microRNA(miRNA)表达的影响,通过深入研究差异表达miRNA在心脏病防治中可能的作用,期望从一个全新的视角揭示复方丹参滴丸对心血管疾病防治的分子作用机制。为了寻找复方丹参滴丸引起的小鼠体内差异表达的内源性miRNA,实验中将喂食500ul 4.4mg/ml复方丹参滴丸溶液的Institute for Cancer Research(ICR)小鼠作为实验组,将喂食等量水的ICR小鼠作为对照组,在0h、0.5h、1h、3h、6h和12h分别取小鼠眼眶静脉血及心、肝、肾、肺和胃等器官,将小鼠眼眶静脉血送公司测序sRNA库,分析测序结果后发现有42条miRNA表达发生明显差异,其中16条表达上调,26条表达下调。经过quantitative reverse-transcription PCR(qRT-PCR)验证后发现16条上调的miRNAs中有12个miRNA表达上调,1个miRNA表达下调,剩余的3个miRNA表达没有明显变化;而26条下调的miRNA中,有20个miRNA表达下调,1个miRNA表达上调,剩余的5个miRNA表达没有明显变化。这42条miRNA均表现出明显的组织特异性。在小鼠心脏中,血液中表达上调的16条miRNA中有11条miRNA表达上调,5条miRNA表达没有明显变化;血液中表达下调的26条miRNA中有21条表现为上调,其余5条miRNA表达没有明显改变。为了验证测序结果中差异表达的miRNA在心肌细胞凋亡和心肌细胞肥大过程中的作用,本实验利用不同心肌肥大诱导剂盐酸苯丙氨酸(PE,10μM)、血管紧张素(AngⅡ,10μg/L)和类胰岛素生长因子1(IGF-1,100n M)诱导原代心肌细胞肥大,并检测肥大诱导的心肌细胞中42条miRNA表达情况,结果发现在42条差异表达的miRNA中,有19条miRNA在PE处理时表达明显下调,有6条miRNA在AngⅡ处理时表达变化最明显,其余5条miRNA在IGF-1处理时表达变化最明显,而miR7084-5p在经过PE和AngⅡ处理后的心肌细胞中均表达上调,IGF-1后表达下调为了探索差异表达的miRNA在心肌细胞肥大及细胞凋亡中的作用,实验中选择5条miRNA—miR-106a-5p、miR-1964-3p、miR-467d-3p、miR-468-3p和miR-672-5p进行验证,结果发现miR106a-3p、miR467d-3p和miR486-3p表达受到抑制后心肌细胞直径明显小于心肌肥大诱导剂诱导后的心肌细胞,MTT法检测细胞存活率,发现miR106a过表达在48h对细胞凋亡有一定的抑制效果,miR672-5p表达受到抑制后细胞凋亡减少。通过上述实验结果,我们猜测复方丹参滴丸可能通过miR106a-5p、miR467d-3p和mi R486-3p表达的调节,进而调控心肌肥大,可能通过调节miR106a-5p和miR672-5p参与调控细胞凋亡过程。
