脐带间充质干细胞的分离鉴定

近年来，由于细胞替代治疗为很多疑难疾病带来了希望，相关研究已经成为整个生命科学和医疗领域的研究热点。目前为止，脐带间充质干细胞已经在多方面被证明是自体和异体细胞移植、治疗的理想细胞。和骨髓间充质干细胞相比，脐带间充质干细胞在生物学特征和免疫学特性上与其相似，但在增殖能力，诱导分化能力上，比骨髓间充质干细胞更有潜能。更为重要的是，骨髓间充质干细胞在取材上有极大的限制，年龄、疾病、对供体的伤害都影响了其进一步的应用。而脐带间充质干细胞来源广泛，取材方便，对供体无不利影响，同时，无伦理道德限制的问题。因此，两种细胞相较而言，脐带间充质干细胞具有更为广阔的应用前景。 本次实验是通过组织块培养法和酶消化法从胎儿的废弃物脐带中分离得到脐带间充质干细胞，在酶消化法处理脐带华通氏胶过程中，采用了三种不同的消化方式，分别是单加入Ⅱ型胶原酶、单加入胰酶以及Ⅱ型胶原酶混合胰酶进行消化。通过观察发现，第三种方式对华通氏胶进行消化的效果最佳，可以在最短的时间内得到最多的细胞。同时在实验中测试最适血清浓度。经实验发现，在原代培养过程中，15%血清浓度最适宜细胞生长。得到细胞后应用流式细胞仪检测来鉴定所获取的细胞，经鉴定细胞表达CD29、CD44、CD73以及CD166，属于典型的脐带间充质干细胞，再通过传代等手段建立起细胞系。在传代过程中随机检测不同代的细胞生长情况，以此来检验实验获取的脐带间充质干细胞能否稳定传代。 在获得能稳定传代的脐带间充质干细胞后，取第三代细胞对其进行诱导分化。由于间充质干细胞为多能性干细胞，可以向三个胚层分化。故此，本实验对间充质干细胞分别向脂肪细胞、成骨细胞以及神经细胞三个方向进行诱导分化。当第三代脐带间充质干细胞生长至占培养皿60%左右时弃掉基础培养液，分别加入成脂诱导液、成骨诱导液和神经细胞诱导液。在成脂诱导过程中，第7天左右细胞有明显变化，出现脂滴，第14天经过油红O染色证实为脂性液体，诱导分化成功；成骨诱导过程中第7天左右细胞开始明显变化，细胞向多角形转变，14天左右出现钙结节，经茜素红染色证实间充质干细胞诱导分化为成骨细胞；向神经细胞诱导过程中，加入诱导液6小时后细胞开始变化，伸出多个突起，随着时间的延长，突起的长度不断增加，形成类似神经样细胞形态。3天后对其进行免疫细胞化学染色显示Nestin表达强阳性，证实向神经细胞方向诱导成功。 通过实验证明，脐带间充质干细胞在脐带组织中分布广泛，含量丰富。通过实验建立了相对成熟、稳定的体外分离培养、扩增脐带间充质干细胞的方法，为其最终应用于临床治疗奠定了理论基础。