人脐血间充质干细胞体外分离培养条件的优化及其鉴定

背景:相对于骨髓间充质干细胞来说,脐血间充质干细胞是一种较为理想的新的组织工程种子细胞来源,但其培养成功率较低。目的:通过对培养基的选择、离心速度及时间、接种密度、生长因子的选择、首次换液时间等条件进行优化,拟建立一种稳定可靠的人脐血间充质干细胞的体外分离培养方法。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/10在白求恩国际和平医院输血科完成。材料:健康足月剖宫产新生儿脐带血20份,由白求恩国际和平医院干细胞中心提供,产妇及其家属均知情同意。方法:无菌条件下采集脐血,采用密度梯度离心法（1500r/min离心15min）结合直接贴壁法体外分离脐血间充质干细胞,加入含体积分数为10%人脐带血血清、5μg/LGM-CSF、15μg/L白细胞介素3的DMEM/F12培养基,调整细胞密度为1×1010L-1接种于人脐带血血清包被过的塑料培养瓶中,置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度环境下培养,3d后首次换液,去除未贴壁细胞,以后每隔24h换液1次。当培养瓶中的细胞生长到80%融合时,胰酶-EDTA混合液消化传代。主要观察指标:倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞免疫表型。结果:24h后可见有少量细胞贴壁,48h后贴壁细胞增多,并出现少量单极梭形细胞,7d后可见细胞形成集落,培养两三周形成平行排列、辐射状或漩涡状细胞界限不清楚的成纤维样细胞,且80%90%呈现融合。第2代细胞接种后12h开始贴壁,10d即可达80%90%融合。流式细胞仪分析显示,此类细胞稳定地表达相关抗原标记CD29及CD44,但不表达造血细胞系表面标记CD34。结论:实验在体外改良培养条件下成功分离出人脐血间充质干细胞,培养周期较短,细胞纯度较高,贴壁细胞稳定表达间充质干细胞表面相关抗原。