Wilson病基因突变体的体外构建及表达研究

目的　研究并比较正常ATP7B蛋白及其突变体蛋白的表达水平 ,为进一步探寻ATP7B蛋白参与铜转运的机制奠定基础。方法　构建含健康人全长Wilson病 (WD)cDNA片段的真核细胞表达质粒ATP7BcDNA/ pcDNA3,定点诱变三种具有代表意义的突变体表达质粒Arg778Leu/pcDNA3、Gln914Ter/ pcDNA3和Thr935Met/ pcDNA3;同时设计并制备包含ATP7B蛋白N端主要功能区的具有高度特异性和敏感性的ATP7Bn33 6 2 9抗体 ;分别以上述质粒瞬时转染中国仓鼠卵细胞 (Chinesehamsterovary ,CHO) ,收集细胞提取蛋白 ,以ATP7Bn33 6 2 9抗体为一抗 ,免疫印迹分析并比较正常和突变体ATP7B蛋白的表达程度。结果　ATP7B蛋白在正常ATP7BcDNA/pcDNA3表达质粒和Arg778Leu/ pcDNA3、Thr935Met/pcDNA3错义突变体表达质粒转染的CHO细胞中表达量一致 ,而在Gln914Ter/ pcDNA3截短突变体表达质粒转染的CHO细胞中表达量明显增加。结论　成功构建了WD突变体表达质粒并在转染细胞中表达 ,为进一步的功能研究打下基础。错义突变未改变ATP7B蛋白表达量 ,提示错义突变引起铜代谢障碍的机制与蛋白表达量无关。截短突变产生的ATP7B蛋白产物表达量增加可能与其所需的翻译时间相对较短有关。