密度梯度离心与贴壁筛选法体外分离培养胎儿骨髓间充质干细胞

背景:胎儿骨髓间充质干细胞与成人相比,具有更好的自我更新和分化能力,以及更低的免疫原性。目的:选择更适应胎儿骨髓间充质干细胞体外分离培养的方法。设计、时间及地点:单一样本细胞学观察,于2005-06/12在中山大学附属第三医院中心实验室完成。材料:16～24周胎龄的流产胎儿由中山大学附属第三医院妇产科提供,产妇及家属均签署知情同意书。方法:无菌条件下截取流产胎儿双侧四肢骨,PBS冲洗髓腔,离心去脂肪及上清液,L-DMEM重悬细胞,沿管壁缓慢滴加至底部有等量1.073g/mLPercoll分离液的离心管中,离心后吸取中间界面白膜层,加入含体积分数为10%的胎牛血清、青霉素钠、链霉素的L-DMEM完全培养基,接种后置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱内培养。48h后换液,去除未贴壁细胞,以后每2d换液一次。待细胞达到80%～90%融合时,胰酶-EDTA消化传代。主要观察指标:倒置显微镜及Giemsa染色观察细胞形态;透射电镜观察细胞超微结构;流式细胞技术检测其表面标记物;碱性磷酸酶染色检测成骨分化能力;Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色检测成软骨分化能力。结果:原代及传代培养的胎儿骨髓间充质干细胞呈梭形外观,具有较强的增殖能力。胞体较小,细胞核/浆比例大,胞核呈圆形或椭圆形,胞浆少,染色质较疏松,表现出早期细胞的特点,传至第20代细胞超微结构仍无明显改变。细胞表面抗原CD29,CD44,CD105呈阳性表达,CD34,CD45呈阴性表达。骨髓间充质干细胞诱导分化后,碱性磷酸酶染色及Ⅱ型胶原均呈阳性。结论:利用密度梯度离心+贴壁筛选法可成功分离培养胎儿骨髓间充质干细胞,所获细胞能够向成骨细胞及软骨细胞分化,该方法为体外培养扩增胎儿骨髓间充质干细胞的简单、稳定、高效的手段。