骨髓间充质干细胞向神经细胞转化过程中神经生长因子及受体的表达

目的:观察骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞过程中神经生长因子及其受体的表达变化情况,以探索骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞的机制。方法:实验于2005-10/2006-08在华北煤炭医学院中心实验室和形态实验室完成。实验方法:①骨髓间充质干细胞的分离和培养:分离纯化健康成年SD大鼠骨髓间充质干细胞进行传代培养。②骨髓间充质干细胞的诱导分化:取第5代细胞,加入含L-DMEM、1mmol/Lβ-巯基乙醇、20%FBS预诱导液进行预诱导,24h后去除预诱导液,加入含L-DMEM、5mmol/Lβ-巯基乙醇诱导液诱导培养5h,应用倒置相差显微镜观察细胞形态变化,采用免疫细胞化学方法鉴定神经细胞。③尼氏小体染色:应用甲苯胺蓝对尼氏小体染色,光镜下观察并照相。④实验评估:对诱导前后细胞进行免疫组织化学检测,并提取诱导前后细胞的mRNA,通过RT-PCR法检测神经生长因子、神经生长因子受体TrkAmRNA表达变化。结果:①骨髓间充质干细胞的培养:骨髓间充质干细胞贴壁生长情况良好,大部分细胞贴壁呈长梭形。传代后细胞形态和原代细胞相似,生长加快。②骨髓间充质干细胞的诱导分化:加入预诱导液后,细胞体积缩小,立体感增强,细胞边缘变得不规整,部分细胞有细的指状突起,其中约2%的细胞胞体已变成近似球形,具有短的突起,形状类似神经元。5h后细胞转化达到峰值,形态不再发生明显改变,具有典型神经细胞样形态,免疫细胞化学检测显示,神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达均呈阳性。③尼氏小体染色:未诱导骨髓间充质干细胞胞浆内无尼氏小体,诱导5h后大部分细胞染色阳性,胞质中存在着深蓝色颗粒状尼氏小体。④RT-PCR反应检测神经生长因子和TrkAmRNA:神经生长因子mRNA表达在诱导前后没有变化,TrkAmRNA在诱导后的表达减少(P<0.05)。结论:①骨髓间充质干细胞成功诱导分化为神经细胞,其在诱导分化为神经细胞前后表达神经生长因子及其受体TrkA。②神经生长因子在诱导分化前后稳定表达,神经生长因子受体TrkA在诱导分化后表达减少,神经生长因子/TrkA信号途径可能在骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞的过程中起作用。