转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点的研究

被引：16

作者：

孔庆然

武美玲

朱江

格日乐其木格

郇延军

尹智

牟彦双

刘忠华

机构：

[1] 东北农业大学生命科学学院

来源：

生物化学与生物物理进展 | 2009年 / 12期

关键词：

转基因猪; 拷贝数; 整合位点; 绝对定量PCR; TAIL-PCR; 纯合性;

D O I：

暂无

中图分类号：

Q78 [基因工程（遗传工程）];

学科分类号：

071007 ; 0836 ; 090102 ;

摘要：

主要采用了绝对定量PCR和热不均一交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR),检测了体细胞核移植技术生产的绿色荧光蛋白转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点,并利用旁侧PCR(Junction PCR)对整合位点进行确定,同时进一步分析了整合位点的纯合性.结果表明,绝对定量PCR可以准确有效地检测外源基因拷贝数,标准曲线为:log2N(拷贝数)=-0.9354△Ct+3.4116(R2=0.9974,P<0.001),两只转基因猪中外源基因拷贝数分别为30.85±1.77和18.87±1.34;TAIL-PCR能成功地克隆转基因猪中外源基因整合位点,得到25条特异性条带,经BLAST比对,共获得TgInS1(1440bp)、TgInS2(1263bp)和TgInS3(1861bp)3个整合位点.以整合位点侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合引发Junction PCR,得到预计大小的特异性片段,确定了整合位点上、下游侧翼序列的准确性.采用整合位点5′上游和3′下游侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合,进行Junction PCR,在两只转基因猪中都得到与野生型猪一致的侧翼序列特异性引物扩增片段,表明我们获得的转基因猪都为整合位点杂合子.初步建立了绝对定量PCR和TAIL-PCR对外源基因拷贝数和整合位点检测的体系,为今后研究外源基因在转基因猪中遗传和表达的稳定性打下了基础.

引用

页码：1617 / 1625

页数：9

共 6 条

[1] 实时荧光定量PCR法检测转基因小鼠拷贝数 [J].

王晓建 ;

杨旭 ;

宋晓东 ;

张禅那 ;

刘继斌 ;

邸冉 ;

张连峰 ;

惠汝太 .

中国实验动物学报, 2007, (03) :170-174

[2] 转基因动物整合位点的研究进展 [J].

吴波 ;

朱作言 .

遗传, 2003, (01) :77-80

[3] 转基因动物制作及提高外源基因表达的策略 [J].

王继英 ;

杜立新 .

中国畜牧兽医, 2002, (02) :30-34

[4]

Integration site analysis in transgenic mice by thermal asymmetric interlaced (TAIL)-PCR: segregating multiple-integrant founder lines and determining zygosity[J] . Manoj M. Pillai,Gopalakrishnan M. Venkataraman,Steven Kosak,Beverly Torok-Storb.Transgenic Research . 2008 (4)

[5] Production of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) over-expressing piglets [J].

Hao, Y. H. ;

Yong, H. Y. ;

Murphy, C. N. ;

Wax, D. ;

Samuel, M. ;

Rieke, A. ;

Lai, L. ;

Liu, Z. ;

Durtschi, D. C. ;

Welbern, V. R. ;

Price, E. M. ;

McAllister, R. M. ;

Turk, J. R. ;

Laughlin, M. H. ;

Prather, R. S. ;

Rucker, E. B. .

TRANSGENIC RESEARCH, 2006, 15 (06) :739-750

[6]

Thermal asymmetric interlaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking[J] . Yao-Guang Liu,Robert F. Whittier.Genomics . 1995 (3)

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