Thermotoga nea politana葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及其酶学性质

目的:从新阿波罗栖热袍菌Thermotoga neapolitana（DSM 4359）中克隆葡萄糖苷酶基因,并将其转化进大肠杆菌中进行体外表达,研究重组酶的酶学性质。方法:以Thermotoga neapolitana基因组DNA为模板,根据该基因序列设计引物,采用PCR法扩增出葡萄糖苷酶基因,将其连接到pET-28a（+）载体上,转化入E.coli BL21（DE3）宿主菌中。经IPTG诱导体外高效表达。研究重组酶的最适反应温度、pH值和底物特异性。结果:PCR扩增得到825bp的片段,编码274个氨基酸,并连接到载体pET-28a（+）上,成功转化到宿主菌中,并在体外进行了高效表达。丙烯酰胺凝胶电泳,目标蛋白相对分子质量约为63 000。重组酶的最适反应温度为75℃,在70℃85℃范围内仍保持60%以上活力。最适反应pH值为5.0,在pH 3.0～6.0范围内仍能保持70%以上活力。最适底物为海藻糖,其次为龙胆二糖,其他糖苷键连接的二糖的活力均很低或没有活力。结论:Thermotoga neapolitana（DSM 4359）中葡萄糖苷酶基因成功克隆并表达于大肠杆菌中。葡萄糖苷酶能特异性水解α-（1→1）糖苷键。