Robo1 RNA干扰慢病毒载体的构建及其基因沉默效应

目的构建Roundabout(Robo1)siRNA慢病毒载体,并在SKOV3卵巢癌细胞中鉴定其转染及基因沉默效果。方法根据GenBank中基因信息,采用干扰序列设计软件设计靶点,制备Robo1DNA片段,在T4DNA连接酶作用下,将线性化的病毒载体GV118与DNA片段制备合成GV118-siRNA目的质粒,转化感受态细胞,对于长出的克隆应用菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和对比分析,重组病毒质粒与另外2种辅助包装原件载体质粒通过LipofectamineTM2000共转染293T细胞,培养48h后,收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度;并检测病毒载体在工具细胞SKOV3卵巢癌细胞中的转染效率,实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot方法检测Robo1siRNA慢病毒对SKOV3中Robo1的干扰作用。结果成功构建Robo1siRNA慢病毒载体GV118-siR-NA,病毒滴度为2×109 TU/mL;用该病毒体外转染SKOV3卵巢癌细胞,当感染复数(MOI)为10时,感染效率大于90%;RT-PCR和Western blot方法检测Robo1基因沉默的效率分别为76.7%、56.0%。结论成功构建了Robo1siR-NA慢病毒载体GV118-siRNA,该病毒载体在体外转染SKOV3卵巢癌细胞的效率较高,且具有显著的基因沉默效果。