毛白杨4-香豆酸:辅酶A连接酶可溶性原核表达及活性检测

被引：31

作者：

范丙友

胡诗宇

陆海

蒋湘宁

机构：

[1] 北京林业大学生物科学与技术学院国家林业局树木花卉育种与生物工程重点开放实验室

来源：

北京林业大学学报 | 2006年 / 02期

关键词：

毛白杨; 4--香豆酸:辅酶A连接酶; 可溶性原核表达; 酶活性;

D O I：

10.13332/j.1000-1522.2006.02.001

中图分类号：

S792.117 [毛白杨];

学科分类号：

090708 [林木遗传育种学];

摘要：

为了进一步研究毛白杨4CL1的酶学特性,构建了毛白杨4CL1原核表达载体pQE31--4CL1.经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了毛白杨4CL1蛋白,SDS--PAGE电泳分析表明该新蛋白的分子量为60 kD,与预测值一致.对毛白杨4CL1蛋白在大肠杆菌中的表达体系进行了优化,确定IPTG的最佳浓度为0.4 mmol/L,诱导时的菌液密度OD600为0.3～0.5,最佳表达时间为2 h.37℃下表达的4CL1融合蛋白以包涵体的形式存在,没有生物学活性.当表达温度从37℃降低为28℃时,可溶性的有生物学活性的毛白杨4CL1蛋白诱导表达获得成功,表达量达11%.以耦联有Ni2+--NTA的琼脂糖为亲和层析填料,金属鳌合亲和柱层析一步纯化获得了电泳纯4CL1蛋白,4CL1蛋白对5种底物的比活性分别为:4--香豆酸3 949.0 pkat/mg,咖啡酸2 214.0 pkat/mg,阿魏酸715.0 pkat/mg,肉桂酸84.9 pkat/mg,而对芥子酸没有生物活性.

引用

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共 5 条

[1]

4-Coumarate: coenzyme A ligase in black locust (Robinia pseudoacacia) catalyses the conversion of sinapate to sinapoyl-CoA [J].