附子对H9c2心肌细胞系线粒体的毒性作用机制

目的研究附子对H9c2心肌细胞的线粒体毒性作用与机制。方法附子水提取物6.25,12.5,25,50和100 g·L-1作用于H9c2细胞24 h,荧光染色和CCK-8法检测细胞存活率;附子水提取物6.25,12.5和25 g·L-1作用于H9c2细胞24 h,流式细胞仪检测线粒体膜电位和活性氧(ROS)生成的变化;使用相应的荧光探针,结合激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内Ca2+、线粒体内Ca2+以及线粒体内超氧化物水平的变化;萤火虫荧光素法检测细胞内ATP浓度变化;实时荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖活化受体共激活因子-1α(Pgc-1α),Bcl-2和Bax m RNA的表达;Western蛋白印迹法检测Pgc-1α蛋白的表达。结果附子水提取物12.5～100 g·L-1作用于H9c2细胞,可显著抑制细胞活性(P<0.05),IC50值为47.4669 g·L-1,95%的可信限32.5997～69.1145 g·L-1。附子水提取物25 g·L-1处理后,ROS的荧光强度由正常对照组的204±67升高到454±78(P<0.05),线粒体超氧化物的荧光强度由5.4±1.8升高到26.8±8.5(P<0.01),线粒体膜电位由1.7±0.5下降到0.8±0.4(P<0.05),线粒体内Ca2+的荧光强度由38.0±4.3下降到9.2±1.6(P<0.01),细胞内Ca2+的荧光强度由7.8±0.8升高到22.1±0.5(P<0.05),细胞内ATP浓度由(10.6±0.4)μmol·g-1下降到(5.3±1.1)μmol·g-1蛋白(P<0.05)。实时荧光定量PCR和Western蛋白印迹检测结果显示,与正常对照组相比,附子水提取物25 g·L-1组Pgc-1α和Bcl-2的m RNA表达分别由正常对照组的1.00±0.10和1.00±0.10下降到0.09±0.06(P<0.01)和0.43±0.06(P<0.01),Bax m RNA表达由1.00±0.03升高到1.17±0.06(P<0.05);Pgc-1α蛋白表达由正常对照组的0.906±0.034下降到0.541±0.003(P<0.01)。结论附子对心肌细胞具有一定的线粒体毒性,其作用是多种途径共同作用的结果。附子的心肌线粒体毒性可能是附子造成心肌毒性的原因。