Rac1蛋白调控表皮干细胞迁移促进创面愈合的研究

目的观察Rac1蛋白对表皮干细胞(ESC)迁移运动的调控作用,为完善创面愈合的基础理论以及指导临床应用提供参考。方法将慢病毒空载体FUGW单独和分别与Rac1蛋白抑制型突变体Rac1T17N、Rac1蛋白活化型突变体Rac1Q61L融合后转染入ESC,按照随机数字表法分为3部分进行如下实验。(1)将ESC分别接种于Ⅰ型胶原溶液(20μg/mL)、Ⅳ胶原溶液(20μg/mL)或纤连蛋白溶液(10μg/mL)包被的24孔细胞培养板,采用CytoTox 96比色试剂盒检测ESC对不同基质的黏附率。(2)选取上述黏附于Ⅳ型胶原的1000个ESC,四甲基异硫氰酸罗丹明标记的鬼笔环肽染色,激光扫描共聚焦显微镜下观察黏附细胞的形态延展并比较面积大小。(3)选用Transwell小室,上室加入ESC、下室中加入含基质细胞衍生因子1(SDF-1)的限定性角质形成细胞无血清培养液(以不加SDF-1的培养液为对照),倒置相差显微镜下观察ESC的趋化能力,结果以细胞迁移变化率表示。(4)将ESC接种于6孔细胞培养板孵育12h,加入含4μg/mL丝裂霉素C的培养液继续孵育2h,于单层贴壁细胞划痕,6、12h后统计剩余划痕宽度百分率。对数据进行t检验。结果与转染FUGW的ESC比较,转染Rac1Q61L的ESC对Ⅰ型胶原的黏附率明显增加(t=5.302,P<0.05),转染Rac1T17N的ESC对Ⅰ型胶原(t=13.741,P<0.05)、Ⅳ型胶原(t=15.676,P<0.05)及纤连蛋白(t=8.256,P<0.05)的黏附率均明显下降。激光扫描共聚焦显微镜下观察,与转染FUGW的ESC比较,转染Rac1Q61L的ESC面积明显增大,细胞边缘有层板状伪足伸出;转染Rac1T17N的ESC面积显著缩小。在趋化因子SDF-1作用下,与转染FUGW的ESC比较,转染Rac1Q61L的ESC迁移变化率升高43.4%,转染Rac1T17N的ESC迁移变化率下降78.0%;无SDF-1作用时,与转染FUGW的ESC比较,转染Rac1T17N的ESC迁移变化率下降55.2%,转染Rac1Q61L的ESC迁移变化率未见明显变化(升高1.7%)。划痕后6、12 h,转染Rac1Q61L的ESC剩余划痕宽度百分率分别为(39±9)%、(6±5)%,低于转染FUGW的ESC[(43±5)%,t=1.027,P>0.05;(18±7)%,t=4.389,P<0.05];划痕后6、12h,转染Rac1T17N的ESC剩余划痕宽度百分率分别为(81±9)%、(71±11)%,明显高于转染FUGW的ESC(t值分别为11.386、11.726,P值均小于0.05)。结论 Rac1蛋白可通过影响ESC的黏附、延展以及趋化能力调控细胞迁移,并可能因此参与ESC促进创面愈合的进程。