重组AAV2-色素上皮衍生因子对人视网膜微血管内皮细胞增殖的影响

目的体外培养人视网膜微血管内皮细胞,探讨重组rAAV2-色素上皮衍生因子（PEDF）对该细胞在不同氧环境下增殖的影响。方法实验研究。2%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶消化视网膜,获得视网膜微血管内皮细胞;接种于预先包被纤维连接蛋白的培养瓶内,用含10%胎牛血清、内皮细胞生长因子、胰岛素-转铁蛋白-硒添加物的内皮细胞培养基,置于5%CO237℃培养箱内培养。相差显微镜观察细胞形态及生长情况。抗第Ⅷ因子相关抗原抗体鉴定内皮细胞。以125μmol/L CoCl2建立HRCECs化学低氧模型,观察低氧对内皮细胞增殖的影响。按照10～5病毒基因组数/细胞的剂量进行rAAV2-PEDF病毒转染,分别设空白和阴性对照,激光共焦显微镜下观察EGFP阳性细胞,免疫印迹法检测PEDF蛋白表达。MTT法测定rAAV2-PEDF对不同氧条件下对细胞增殖的影响。流式细胞仪检测rAAV2-PEDF对不同氧条件下对细胞凋亡的影响。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用方差分析。结果原代培养的人视网膜微血管内皮细胞48～72 h贴壁,2周左右细胞融合。第Ⅷ因子相关抗原鉴定细胞呈阳性。转染病毒48 h后,激光共焦显微镜下观察可见EGFP阳性细胞,免疫印迹法检测,实验组PEDF表达明显强于其他组。MTT结果显示,单纯低氧处理,正常对照组A值为0.085±0.021,实验组A值为0.166±0.024（t=3.938,P<0.05）。rAAV2-PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,A值分别为:正常对照组0.171±0.011,rAAV2-EGFP组0.178±0.016,rAAV2-PEDF组0.169±0.017（F=0.01,P>0.05）。rAAV2-PEDF干预低氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,A值分别为:单纯CoCl2组0.166±0.013,CoCl2+rAAV2-EGFP组0.155±0.012,CoCl2+rAAV2-PEDF组0.116±0.015（F=6.25,3.50;P<0.05）。rAAV2-PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,正常对照组凋亡细胞比例为2.3%,rAAV2-EGFP组为3.3%,rAAV2-PEDF组为1.7%。rAAV2-PEDF干预低氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,单纯CoCl2组凋亡细胞比例为3.6%,CoCl2+rAAV2-EGFP组为6.7%,CoCl2+rAAV2-PEDF组为36.4%。结论rAAV2-PEDF转染人视网膜微血管内皮细胞后PEDF可稳定表达,并能显著抑制低氧诱导下内皮细胞的增殖。