3种条件性致病菌三重PCR检测方法的建立及初步应用

本研究旨在建立一种能同时检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae)的三重PCR检测方法。根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌toxR基因、肺炎克雷伯杆菌PhoE基因设计并合成引物,在单一PCR条件基础上优化建立三重PCR反应条件,并进行特异性、敏感性和重复性分析及与细菌分离培养的比对试验。结果显示,3对引物均能特异性扩增出目的条带,大小分别为484、278和368bp。最佳退火温度在56～59℃之间,引物浓度均为0.2μmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,Mg2+浓度为2.5mmol/L。3种细菌间无交叉反应。对支气管鲍特杆菌等其他8种实验动物常见致病菌均无交叉反应。最低能同时检测到10-5 ng/μL的细菌基因组DNA。3次重复结果一致,表明建立的三重PCR方法重复性好。同时采用细菌分离培养法和三重PCR方法对30份实验小鼠样本进行检测,对比结果显示三重PCR方法检出率略高于细菌分离培养法,细菌分离培养法呈阳性的样品,三重PCR方法均能检出。结果表明,本试验建立的三重PCR检测方法具有特异、敏感、高效等优点,为实验动物细菌快速检测和流行病学调查提供了技术支持。