芍药Actin基因在大肠杆菌中的高效表达

目的构建芍药Paeonia lactiflora Actin(Pl Actin)基因原核表达载体,优化Pl Actin基因在大肠杆菌中的高效表达体系。方法基于Pl Actin基因c DNA序列及原核表达载体p ET-32a(+)多克隆位点序列,设计一对5’末端分别插入Bam H I和Hind III酶切位点的特异性PCR引物,基于RT-PCR技术亚克隆Pl Actin基因;用Bam H I和Hind III双酶切重组质粒p MD18-T-Pl Actin和原核表达载体p ET-32a(+),胶回收纯化目的基因和空载体,连接、转化后应用菌落PCR、质粒PCR和双酶切鉴定出重组子p ET-32a(+)-Pl Actin,转化BL21(DE3)菌株获得基因表达工程菌;分别设置诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度梯度、诱导的菌体起始密度梯度及表达时间梯度,诱导Pl Actin基因在大肠杆菌中表达,SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝R250染色后制备干胶并比较重组Actin蛋白的表达量。结果亚克隆测序结果表明Pl Actin与目的序列完全一致,且其编码区序列(CDS)上下游成功插入了Bam H I和Hind III酶切位点;成功构建了芍药原核表达载体p ET-32a(+)-Pl Actin;诱导剂IPTG的最佳浓度为0.1 mmol/L,诱导的菌体起始密度(A600)为0.4～0.6,最佳表达时间为4 h。结论构建了Pl Actin基因原核表达载体p ET-32a(+)-Pl Actin,建立了Pl Actin基因在大肠杆菌中的高效表达体系。