狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库的构建

目的:采用抑制性消减杂交技术构建汉族人狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库。方法:选择2005-08/10南方医科大学南方医院中医科收治的狼疮性肾炎肾阳虚证患者5例,另选择与上述年龄相匹配的健康正常人5名作为正常对照组。狼疮性肾炎肾阳虚证患者组和正常对照组进行正向和反向消减杂交。采用Trizol一步法提取总RNA,用SMART(Switch Mechanism At 5 end of RNATemplate)技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片断,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将聚合酶链反应产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用聚合酶链反应方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建狼疮性肾炎肾阳虚证消减文库。结果:TRIzol一步法抽提的总RNA纯度高(A260/A280nmnm>1.90),用SMART技术扩增微量RNA,扩增产物双链cDNA主要分布在0.5～10kb,基因组cDNA经RsaI内切酶酶切后片段主要集中在200～2000bp。用抑制性消减杂交方法筛选出了狼疮性肾炎肾阳虚证的差异cDNA片段,得到了480个白色克隆,再经聚合酶链反应方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了狼疮性肾炎肾阳虚证的cDNA消减文库。结论:抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆狼疮性肾炎肾阳虚证相关基因奠定了基础。