牦牛乳酸脱氢酶A的分离纯化、酶学性质及其基因的克隆

【目的】分离纯化牦牛骨骼肌中的乳酸脱氢酶-A(LDH-A),并克隆其cDNA。通过比较牦牛与普通牛的LDH-A的酶学性质和cDNA序列,为研究牦牛适应高海拔、低氧环境,在分子水平上找到一些线索。【方法】采用染料亲和层析和DEAE-Sephadex离子交换层析等方法,分别从牦牛和普通牛骨骼肌中纯化LDH-A,并对其酶学性质进行比较;通过RT-PCR方法克隆牦牛LDH-A的cDNA序列,并与GenBank登录的普通牛LDH-A的cDNA序列进行比对。【结果】纯化的牦牛LDH-A比活力为103.9U·mg-1蛋白,纯化倍数为18.2。SDS-PAGE和PAGE分析均显示一条带。酶动力学参数测定显示,牦牛LDH-A的KmNADH为0.097,Km丙酮酸钠为1.897,均不同程度高于普通牛,其中对丙酮酸钠的Km大约是普通牛的2倍。根据牦牛LDH-A的cDNA序列预测的氨基酸序列与普通牛LDH-A的氨基酸序列比较,只有2个氨基酸残基的改变(257Val-Ala和315Tyr-Cys)。【结论】牦牛LDH-A对丙酮酸的高Km可避免骨骼肌中产生过多的乳酸,是适应进化的结果;这种升高可能与其氨基酸序列变化导致的空间结构微小改变有关。