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大鼠B细胞淋巴瘤-2基因的克隆及其慢病毒表达载体的构建
被引:4
作者:

王雪峰
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何援利
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[1] 南方医科大学珠江医院妇产科
来源:
关键词:
基因,bcl-2;
DNA,互补;
遗传载体;
病毒;
D O I:
暂无
中图分类号:
R346 [];
学科分类号:
摘要:
目的克隆大鼠B细胞淋巴瘤-2(bcl-2)基因全长cDNA,构建及鉴定大鼠bcl-2基因慢病毒表达载体。方法采用RT-PCR法从大鼠脾脏组织中扩增全长bcl-2 cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体中,测序正确后,将基因连接到慢病毒载体pGC-FU(含EGFP基因)中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-bcl-2,将pGC-FU-bcl-2质粒和包装质粒(pHelper1.0、pHelp-er2.0)共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞后,细胞即可分泌携带bcl-2基因的重组慢病毒。将重组慢病毒感染293T细胞,通过Western blot-ting鉴定目的蛋白bcl-2的表达。结果经DNA序列分析测定证实大鼠bcl-2基因序列与GenBank中一致;pGC-FU-bcl-2中携有正确的bcl-2基因,并能转染人胚肾上皮细胞;pGC-FU-bcl-2及包装质粒共转染包装细胞293T细胞能产生重组病毒pGC-FU-bcl-2;目的基因bcl-2能被重组慢病毒高效地转导入人胚肾上皮细胞中,并达到稳定表达,荧光显微镜下能直接观察到荧光蛋白,Westernblotting能检测到bcl-2蛋白在靶细胞中的表达。结论成功克隆了大鼠bcl-2基因并构建了重组慢病毒载体,包装出高浓度慢病毒,转染人胚肾上皮细胞后能够稳定表达bcl-2基因,为进一步研究该基因的功能及细胞凋亡相关疾病的治疗奠定了基础。
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沈铿
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杨佳欣
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