体外拼装凋亡素基因

目的以凋亡素基因为例,探讨用寡核苷酸片段体外拼装基因的方法。方法按已知的凋亡素基因序列(GeneBank登录号:AY171617),设计40bp的凋亡素基因寡核苷酸片段,并将其中的172位(BglII,agatct→agatcc)和306位碱基(HindIII,aagctt→aatcct)进行同义突变,Taq消除这两个酶切位点。在pfu酶的PCR系统中,对寡核苷酸片段进行拼装和扩增。产物稀释后进一步纯化扩增,在Tag酶存在的条件下对产物两末端加T,然后TA克隆于pGEM-Teasy载体中。阳性克隆经测序鉴定。结果凋亡素基因寡核苷酸片段第1次PCR拼装后,产物呈拖尾状。但产物经进一步稀释,并用两未端引物进行2次扩增后,即可见明确的产物带及其他梯形带状产物。目的产物TA克隆后,筛选得到阳性克隆,其经测序鉴定,与设计的凋亡素基因序列完全一致。结论体外基因拼装法是一种非常有效的基因克隆方法,可用于基因或载体的合成,及一次性对基因进行广泛的突变。