刀豆蛋白致小鼠免疫性肝损伤MAPEG家族表达谱及环孢素调控

肝脏损伤是一个复杂的病理过程,涉及众多炎症介质和致病因素。在许多肝病发生发展过程中都涉及了病理性免疫反应,而多年来所应用的实验肝损害模型（如细菌脂多糖、D-氨基半乳糖所介导的肝损害）,尚不能很好地反映这一病理特点,因此探索免疫性肝损伤代表性较好的病理模型,无论对病理过程理解还是确认药物靶标均具有重要意义。1992年,Tiegs应用刀豆蛋白（Concanavalin A,ConA）诱发小鼠特异性肝损伤,被证实是由T淋巴细胞介导的免疫性肝损害,因而被广泛应用于肝细胞损害的细胞与分子生物学机制以及药物筛选的研究。 在对肝脏损伤机理的深入研究中,发现花生四烯酸代谢产物作为一类具有重要生物活性的脂类前体物质,在调节肝脏生理和病理过程中起着重要作用。并且,随着花生四烯酸代谢通路中各种相关酶的发现,尤其是涉及谷胱甘肽与类花生酸代谢相关的膜结合蛋白超家族（membrane associated proteins in eicosanoid andglutathione metabolism,MAPEG superfamily）成员结构与功能确定,花生四烯酸代谢调控及其炎性终产物与各种肝损伤间相关研究已引起关注,但是与免疫性肝损伤间的关联性仍远未阐明。因此,本研究采用ConA诱导小鼠肝损伤,观察了花生四烯酸代谢通路中相关代谢酶MAPEG家族在免疫性肝损伤中的表达,并进一步研究了其与细胞因子和MAPK信号通路之间的联系。此外,尚应用免疫抑制剂环孢素（cyclosporin A,CsA）预给药,特异性抑制ConA造成的肝损伤,并从产物和蛋白水平探讨了白三烯通路是否涉及了免疫抑制剂对于免疫性肝损伤的保护过程。 第一部分刀豆蛋白致小鼠肝损伤中MAPEG家族表达谱与花生四烯酸代谢 目的:研究刀豆蛋白（Con A）诱导小鼠免疫性肝损伤中花生四烯酸终端产物PGE2和cysLTs的变化,及其代谢通路中MAPEG家族成员表达谱。 方法:雄性Balb/c小鼠,体重20±2g,随机分为5组,每组6只。除阴性对照组尾静脉注射生理盐水外,其他均尾静脉注射Con A（20 mg/kg）造模,分别在造模后1,2,6,8 h处死动物并收集生物样本。以血清ALT、AST和HE染色组织病理改变作为肝损伤指标。同时以ELISA法检测肝脏cysLTs含量,及其血清相关细胞因子TNF-α、IFN-γ;RIA法检测肝脏PGE2含量。RT-PCR法检测MAPEG家族mPGES,mGST2,mGST3和LTC4S的mRNA表达,免疫组化法检测mGST2的表达,Western blot法检测mPGES,mGST3和LTC4S及MAPK信号通路的表达情况。 结果:ALT、AST和HE病理结果显示尾静脉注射Con A后2 h即出现肝损伤,之后损伤程度加深,8 h达到高峰;Con A损伤早期,肝脏cysLTs含量显著上升,随后缓慢下降,而PGE2变化不显著;基因和蛋白水平的检测结果显示各时间点mPGES变化不大,而LTC4S,mGST2和mGST3的表达随时间延长而增强;其他MAPEG家族相关成员中,5-LO、FLAP和cysLT1R蛋白表达在2～6 h达到高峰,8 h后恢复至正常水平;另外,Con A肝损伤中的两个最重要的细胞因子TNF-α和IFN-γ均在Con A肝损伤的早期呈一过性升高,而MAPK通路中的p-ERK、p-p38和p-JNK等变化也主要出现在肝损伤早期。 第二部分环孢素保护小鼠刀豆蛋白肝损伤MAPEG家族表达改变及其产物cysLTs含量变化 目的:探讨环孢素（CsA）保护小鼠免疫性肝损伤过程中,是否涉及了白三烯通路改变,及其对MAPEG家族表达的影响。 方法:雄性Balb/c小鼠随机分为5组,阴性对照组尾静脉注射生理盐水;尾静脉注射Con A（20 mg/kg）2 h、8 h制备小鼠免疫性肝损伤早、晚期模型;另设造模前15 h和1 h两次尾静脉注射CsA（100 mg/kg）,之后分别注射生理盐水和Con A（20 mg/kg）,2 h和8 h后处死,为CsA单用组和CsA/Con A组。血清ALT、AST和HE染色组织病理改变作为肝损伤指标,ELISA法检测肝脏cysLTs含量,Western blot法检测MAPEG家族变化。 结果:CsA预给药有效改善了Con A引起的肝脏损伤,使血清ALT、AST显著下降,并抑制cysLTs表达增加;CsA预给药尚能抑制Con A引起的mGST3和5-LO表达升高,但对LTC4S,FLAP和cysLT1R表达升高的抑制不明显。 全文结论: 1、ConA诱导小鼠肝损伤过程,伴有cysLTs表达增加,FLAP、LTC4S、mGST2和mGST3基因/蛋白表达上调,而对mPGES基因/蛋白表达无明显影响;CsA预给药可有效抑制肝损伤,并减少cysLTs的表达增加,降低mGST3的表达上调,但对FLAP和LTC4S表达的影响不大。 2、ConA诱导小鼠肝损伤过程增强了5-LO和cysLT1R的表达,而CsA预给药可降低ConA引起的5-LO表达升高,但对cysLT1R表达升高的抑制不明显。 3、ConA诱导小鼠肝损伤过程中,MAPK通路率先激活,介导了两大细胞因子TNF-α、IFN-γ的表达增加,推测与肝脏FLAP、LTC4S和mGST3介导花生四烯酸代谢终产物cysLTs的表达增加,既而产生肝脏损伤相关。