青刺果总黄酮的提取工艺及其对肉鸡的免疫调节作用

目的:探讨青刺果总黄酮的提取工艺及其对肉鸡的免疫调节作用。 实验1:青刺果总黄酮提取工艺的筛选 方法:从乙醇提取法、热水提取法、碱溶酸沉法中筛选青刺果总黄酮提取率最高的方法,考虑乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间四个因素作单因素分析,再用L9（3～4）正交试验对这四个因素进行优化。采用颜色反应对青刺果总黄酮进行鉴别（盐酸—镁粉反应由黄变红、NaBH4反应产生红紫色、AlCl3反应和MgAC2反应在紫外365nm下呈蓝绿色荧光、锆—枸橼酸反应呈亮黄色,加2%枸橼酸甲醇溶液后褪色、PbAC2反应有黄色沉淀、H3BO3反应呈黄绿色,略带荧光）。用紫外分光光度法测定青刺果总黄酮的含量。 结果:青刺果总黄酮最佳提取工艺为:乙醇浓度60%,料液比1:20,温度80℃,提取时间3h。颜色反应鉴定提取物为黄酮。紫外分光光度法测得青刺果总黄酮的含量为5.23%。实验2:青刺果总黄酮对肉鸡免疫调节作用 方法:将60只1日龄鸡随机分为三组,每组20只。Ⅰ组为对照组,喂以基础日粮;Ⅱ、Ⅲ组为试验组,分别在基础日粮中添加青刺果总黄酮200mg/kg和400mg/kg。选择增重效果最明显组分别在14、21和28日龄时采集血样和免疫脏器（脾脏、法氏囊、胸腺）。血样用于测定血清抗体水平和血液生化指标、红细胞C3b受体花环率（erythrocyte C3b receptor ratio,缩写为E-C3bRR）、红细胞免疫复合物花环率（erythro-cyte immune compound ratio,缩写为E-ICR）、总淋巴细胞玫瑰花环率（T-lymphocyte erthrocyte total rosette rates,缩写为Et）、活性淋巴细胞玫瑰花环率（T-lymphocyte erthrocyte active rosette rates,缩写为Ea）、T淋巴细胞百分率。免疫脏器用于测定脏器指数、免疫器官中T淋巴细胞和巨噬细胞数量。同时制作石蜡切片,苏木素伊红（H、E）染色后观察免疫器官的组织学结构变化并测定法氏囊淋巴滤泡直径。脾脏组织制作电镜切片,电镜下观察脾脏超微结构的变化。 结果:青刺果总黄酮对肉鸡血清抗体和血液生化指标的影响表现为:青刺果总黄酮组与对照组相比,21日龄时,IgM表现为极显著升高（p＜0.01）;28日龄时,IgG和IgM表现为显著升高（p＜0.05）;其它均有所提高,但差异不显著（p＞0.05）。各项血液生化指标与对照组相比差异不显著（p＞0.05）。 青刺果总黄酮对肉鸡红细胞免疫和外周血T淋巴细胞免疫的影响表现为:青刺果总黄酮组与对照组相比,红细胞C3b受体花环率和免疫复合物花环率各日龄均有升高趋势,但差异不显著（p＞0.05）;活性淋巴细胞玫瑰花环率在各日龄均极显著升高（p＜0.01）,总淋巴细胞玫瑰花环率在21日龄时极显著升高（p＜0.01）;21、28日龄T淋巴细胞百分率极显著升高（p＜0.01）。 青刺果总黄酮对肉鸡免疫器官及其免疫活性细胞动态变化的影响表现为:与对照组相比,21日龄时,法氏囊指数和胸腺指数显著升高（p＜0.05）,28日龄时,脾脏指数和法氏囊指数显著升高（p＜0.05）,胸腺指数极显著升高（p＜0.01）;各日龄免疫器官中T淋巴细胞数均较对照组显著升高（p＜0.05）,其中14日龄的脾脏、21日龄的法氏囊和胸腺、28日龄的脾脏和法氏囊中的T淋巴细胞数量则表现为极显著升高（p＜0.01）;28日龄时,免疫器官中巨噬细胞数均显著高于对照组（p＜0.05）。综合长轴短轴的变化来看,各日龄法氏囊淋巴滤泡直径均显著增大（p＜0.05）。 青刺果总黄酮对肉鸡免疫器官组织学的影响表现为:光镜下,7日龄时,各免疫脏器组织还未发育成熟,脾脏组织红髓白髓尚未分化;法氏囊粘膜高低不平,细胞排列稀疏;胸腺内的淋巴细胞主要为未成熟的大、中淋巴细胞。14日龄时,与对照组相比,脾脏红髓白髓已开始分化,中央动脉周围淋巴细数量增多;法氏囊皮质髓质开始分化,粘膜较平整,滤泡较大;胸腺皮质髓质分界明显,细胞排列紧密。21日龄时,与对照组相比,脾脏组织红髓白髓已明显可辨,生发中心数量增多,中央动脉周围淋巴鞘面积大;法氏囊粘膜平整,皮质髓质分界明显;胸腺组织以中小淋巴细胞为主,可见胸腺小体。28日龄时,与对照组相比,脾脏红髓白髓清晰可辨,生发中心周围形成大量淋巴鞘。法氏囊粘膜非常平整,细胞排列密集;胸腺组织以成熟小淋巴细胞为主,胸腺小体数量增多。电镜下,青刺果总黄酮组与对照组相比较,脾脏淋巴细胞核仁增多,核染色质边移。 结论:本研究通过正交实验建立了青刺果总黄酮的最佳提取工艺:乙醇浓度为60%,料液比为1:20,温度为80℃,提取时间为3h。并通过颜色反应对其进行了鉴定,建立了紫外分光光度法测定青刺果总黄酮含量的方法。结果显示本方法简便、快速和准确,可用于青刺果总黄酮的定性和定量分析。 青刺果总黄酮对肉鸡的免疫调节试验结果表明:青刺果总黄酮可通过提高血清抗体水平来提高机体的免疫能力且对机体各项血液生化指标无不良影响,并能促进免疫器官的发育,增加免疫器官组织中T淋巴细胞和巨噬细胞的数量,促进法氏囊、脾脏和胸腺的早期发育,对机体的免疫应答功能具有一定的增强作用。