通天草提取物对β-淀粉样蛋白诱导的AD大鼠的保护作用及分子机制研究

目的：研究通天草提取物对老年痴呆(AD)大鼠的保护作用及机制。 方法：通天草提取物由本实验室提取并制成水提物和醇提物。将初筛后的大鼠随机分成以下8组：阴性对照组、假手术组、AD模型组、西药治疗组、通天草醇提物低剂量组和高剂量组、水提物低剂量组和高剂量组。采用脑内注射Aβ1-40(10μg/鼠),建立大鼠老年痴呆模型,然后给予通天草提取物治疗28d。采用Morris水迷宫实验检测大鼠的学习记忆等行为学能力；采用HE染色和透射电镜对海马组织进行病理学检测；血清中GSH-Px和T-SOD的活力以及MDA含量采用分光光度法进行测定；采用ELISA法检测血清中IL-1、IL-6、TNF-α的水平；采用免疫组织化学方法检测nNOS、iNOS、bcl-2、bax、GFAP蛋白的表达；采用RT-PCR法检测海马组织中NF-κB、IκB、H SP70、APP和BACE1mRNA的表达。 结果 1、通过Morris水迷宫实验和病理学检测结果,可以肯定本实验成功建立了Aβ诱导的AD大鼠模型。主要表现为逃避潜伏期明显延长AD模型组为(45.5±6.25)s,明显高于阴性对照组(24.5±5.75)s。AD模型组的穿越跳台次数(1.7±0.89)明显低于阴性对照组(3.2±1.27)。透射电镜结果显示,AD模型组海马神经元细胞间隔增大,突触明显减少,突触小泡融合,肿胀明显；神经元细胞皱缩明显,核膜皱缩并出现阶段性融合,核形异常,异染色质聚集,细胞器如线粒体、核糖体、溶酶体损伤明显,脂褐素异常增多 2、通天草提取物能明显改善AD大鼠的学习记忆能力。低、高剂量的醇提物投予动物后,能以剂量依赖方式明显缩短大鼠的逃避潜伏期,分别为(34.5±7.25)s和(24.0±6.5)s,与AD模型组(45.5±7.3)比较,差异有统计学意义；高剂量醇提物的降低作用与西药治疗组相似。同时通天草提取物各组均在不同程度上增加了大鼠穿越跳台的次数,高剂量醇提物的作用尤为明显 3、病理学HE染色结果可见,高剂量醇提物作用组大鼠海马区神经元细胞数量较AD模型组明显增多,神经元细胞核形态及排列紧密度上均明显改善,类似于西药治疗组。透射电镜可见,与AD模型组大鼠海马神经元细胞(细胞膜、细胞器等)的明显损伤相比,西药治疗组神经元细胞间界限清晰,连接较紧密,核形基本正常,核糖体、线粒体结构基本正常,脂褐素增多不明显,但仍可见毛细血管及星形胶质细胞肿胀；高剂量的通天草水提物和醇提物组海马神经元细胞皱缩不明显,突触数量有一定的增加,神经元细胞核尚欠规则,低剂量醇提物组可见大量的自噬体存在。 4、血清学检测结果发现,通天草提取物各组能明显抑制血清中Aβ1-40水平,与AD模型组(316.8±28.2pg/mL)相比,差异有显著性(p<0.05,p<0.01),醇提物的作用更明显。通天草醇提物(高、低剂量)和水提物高剂量组能明显降低MDA水平,同时增加GSH-Px的活性；通天草提取物各组均能增加T-SOD的活性,与AD模型组比较,差异显著(p<0.01,p<0.05)。血清学炎症因子(IL-1、IL-6、TNF-α)检测结果显示,通天草提取物各组均能在一定程度上降低Aβ诱发的炎症因子分泌,特别是高剂量醇提物对各炎症因子的抑制作用更加明显。 5、大鼠海马组织的免疫组化结果显示,通天草提取物能抑制Aβ诱导的海马GFAP蛋白的表达,诱导抗凋亡蛋白bcl-2同时抑制促凋亡蛋白bax蛋白的表达,使bcl-2/bax的比值增加。此外,高剂量的通天草提取物(醇提物和水提物)能明显抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达,同时促进神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的表达 6、RT-PCR结果显示,通天草提取物能明显降低Aβ前体APP mRNA的表达,同时降低APP的β-裂解酶BACE1mRNA表达,高剂量醇提物的抑制作用尤为明显。此外,通天草提取物(特别是醇提物)能明显降低NF-κB mRNA的表达,同时增强其抑制因子IκB mRNA的表达。HSP70的表达在AD模型组并无显著变化(与阴性对照组比较,p>0.05)。 结论 1、采用脑内注射Aβ蛋白,成功建立了Aβ诱导的AD大鼠模型。 2、通天草提取物能明显改善AD大鼠的学习记忆能力,高剂量醇提物的作用与西药治疗组相似。通天草提取物能部分改善Aβ对大鼠海马神经元细胞的病理学表现。通天草提取物能明显抑制血清中Aβ1-40水平,该作用与抑制Aβ前体物APP mRNA的表达、降低APP裂解酶BACE1mRNA的表达有关。 3、通天草提取物保护AD大鼠的可能分子机制如下 (1)通过诱导GSH-Px和T-SOD的活性、抑制MDA生成而增强抗氧化能力; (2)通过抑制炎症因子IL-1、IL-6和TNF-α的分泌,降低Aβ引起的炎性损伤,该作用与NF-κB/IκB调节通路及iNOS有关。 (3)通过诱导bcl-2蛋白同时抑制bax蛋白的表达,抑制海马神经细胞凋亡；通过抑制海马星形胶质细胞中GFAP蛋白的表达来增加神经突触的传递能力；通过诱导nNOS的表达来发挥神经保护作用。