大黄及其主要成份的毒性毒理研究

大黄为我国四大最常用的中药之一，全国8000多种中药制剂中约有800多种含有大黄，是治疗多种疾病的重要中药，被称为中药“四大金刚”之一，在临床上有着广泛的应用。大黄药理有效成分主要为蒽醌类化合物，包括大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚等。以往研究发现大黄可能具有肝肾毒性和致癌的潜力，但是对大黄中主要成份的毒性比较研究及毒性机制研究报道甚少，目前尚没有明确的定论。本课题采用体内、体外多种实验方法研究和探讨了大黄毒性反应的作用靶器官，大黄中主要成份的毒性比较研究，在此基础上利用代谢组学技术，探讨了大黄素等蒽醌的毒理学作用机制，初步证明了大黄毒性的客观真实性，为大黄的临床安全应用提供了参考依据。 研究发现大黄重复给药6个月产生毒性反应的剂量为10g／kg／d，无明显毒性反应的剂量为2.5g／kg／d（相当于临床常用剂量10g的15倍，换算成人的等效剂量约为0.4g／kg／d），对SD大鼠的主要毒性表现为动物排稀便、软便、体重增长抑制，被毛脏乱、红染，精神不振等，血液生化检查发现BUN略有升高，病理检查发现大黄引起大鼠肾小管上皮细胞内色素沉积和水样变性、肝细胞轻度萎缩、肠粘膜轻度增厚。毒性反应主要靶器官为肾脏，毒性部位为肾小管上皮细胞，肝脏也可能是其毒性靶器官之一，上述毒性损害均可逆。 大黄中几种主要成份体外毒性比较试验发现，大黄素等对HK-2细胞增殖抑制的IC50值分别为：大黄酸82.97μM，大黄素甲醚76.02μM，大黄素130.65μM，其毒性大小顺序为：大黄素甲醚＞大黄酸＞大黄素＞芦荟大黄素＞大黄酚；对于HepG2细胞的其IC50值分别为：大黄酸67.71μM，大黄素125.30μM，毒性大小顺序为：大黄酸＞大黄素＞芦荟大黄素＞大黄酚和大黄素甲醚。大黄素等均能引起两种细胞增殖抑制，细胞萎缩和空泡化，LDH漏出率增加，线粒体膜电位降低，细胞出现明显的凋亡，大黄素使HK-2细胞周期阻滞在S期，而对HepG2细胞的周期没有明显的影响。Western印渍分析凋亡相关蛋白显示，大黄素和大黄酸处理HK-2细胞后，抑制细胞外信号调节激酶1／2（extracelluar signal regulated kinase 1／2，ERK1／2）的磷酸化，并且呈现明显的剂量和时间效应关系，细胞内Bcl-2表达降低，Bax没有明显的变化，致使促凋亡基因蛋白占优势，细胞向促调亡的方向发展，细胞色素c释放增加，从而使Caspase-8活化，激活下游caspase3，引起细胞的凋亡；对HK-2细胞的损伤效应可能是通过MAPK／ERK信号转导通路抑制ERK磷酸化，而导致了细胞周期阻滞和凋亡。Ames波动试验结果表明大黄素在加有S9时具有弱的致突变性，是间接遗传毒性物质，大黄酸和大黄酚没有致突变性；体内试验发现大黄素对CYP450尤其是CYP1A1具有一定的诱导作用，表明大黄素还可能具有潜在的促癌作用。大黄素是大黄中含量最高的蒽醌成份，因此大黄素可能是大黄主要的毒性作用物质之一。 利用NMR技术研究大黄素处理后大鼠尿液、血浆和肾脏组织萃取物中内源性代谢产物谱的变化，研究发现血浆中肌氨酸、异丁酸盐和3-羟基丁氨酸（3-HB）升高，而乳酸、胆碱／磷酸卵磷酯、葡萄糖和多种氨基酸及VLDL／LDL等明显下降；尿液中肌酐、TMAO、醋酸盐、乳酸、葡萄糖和各种氨基酸明显升高，而柠檬酸盐、马尿酸和2-酮戊二酸含量下降，尿液中葡萄糖和氨基酸升高是肾小管损伤的典型标志；肾组织萃取物中醋酸盐、3-HB和肌酐明显增加，而乳酸和胆碱／磷酸卵磷脂下降；脂溶性成分中甘油三脂和细胞膜组成成份等脂类的比例发生改变；由此可以推测大黄素可能是通过改变脂类代谢，导致脂类成分的改变，破坏细胞膜性结构，致使肾小管上皮细胞受损而造成重吸收障碍。尿液中的氨基酸、葡萄糖、TMAO以及肌酐可以作为大黄素的主要生物标志物研究。 综上，大黄毒作用靶器官主要是肾脏，尤其是肾近曲小管上皮细胞，肝脏也可能是其毒性靶器官之一，大黄素是主要的毒性成分，损伤机制可能为大黄素通过MAPK／ERK信号转导通路抑制ERK磷酸化，肾脏脂类成分的改变，致使肾小管上皮细胞线粒体外膜受到损伤，细胞色素C从线粒体释放，进而引发细胞凋亡，导致肾小管重吸收障碍，从而形成氨基酸尿和葡萄糖尿，这种毒性作用是可逆的。 大黄的临床应用十分广泛，正常情况下使用大黄是安全的，但长期、大剂量使用会出现毒性反应，因此在临床上长期用药不要超过0.4g／kg／日，肝肾损伤患者应用时需要调整剂量，长期应用时要注意监测其肝肾功能。其他含蒽醌类药物如芦荟、决明子和虎杖等可能也有类似的毒性毒理机制，因此，应该建立质量标准，控制毒性成份的含量，加强对此类药物的不良反应监测。随着代谢组学技术的发展，此项新技术将会越来越多的用于其他中草药毒性毒理的研究，对于实现中药现代化具有重要的意义。